【正文】 equence． IVS)都具有酶的催化活性，它們是最早被發(fā)現(xiàn)的具有催化作用的 RNA分子 —— 核酶（ ribozyme），為 RNA轉(zhuǎn)錄后加工機(jī)制提供了新的認(rèn)識，并為生命起源的探討開拓了新的境界。 RNA 與 DNA、蛋白質(zhì)，甚至 RNA本身都能發(fā)生相互作用，在生命活動的各個環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要功能。 （二）代謝組學(xué)的主要分析工具： 核磁共振、色譜及 MS ? 代謝組學(xué)研究側(cè)重于代謝物的組成、特性與變化規(guī)律，與生理學(xué)的聯(lián)系更加緊密。 生命過程的表觀、生物化學(xué)的終極目標(biāo)。 與蛋白質(zhì)組研究相關(guān)的數(shù)據(jù)庫 疾病基因組學(xué)： 研究疾病相關(guān)基因、揭示疾病發(fā)病機(jī)制 ? 疾病基因組學(xué)研究的兩大任務(wù)： – 疾病基因或疾病相關(guān)基因 – 疾病易感性的遺傳學(xué)基礎(chǔ) 藥物基因組學(xué)： 研究遺傳變異對藥物效能和毒性的影響 藥物基因組學(xué)（ pharmacogenomics） – 是 功能基因組學(xué) 與 分子藥理學(xué) 的有機(jī)結(jié)合，它不是以發(fā)現(xiàn)人體基因組基因?yàn)橹饕康模沁\(yùn)用已知的基因組學(xué)知識改善患者的治療。 ? RNA組學(xué)研究范疇： 小分子 RNA，包括 snRNA、 snoRNA、 scRNA、 催化性小 RNA（ small catalytic RNA） 、 小片段干涉 RNA（ small interfering RNA， siRNA） 、 微小 RNA（ microRNA， miRNA） 以細(xì)胞、組織或機(jī)體在特定時間和空間上表達(dá)的 所有蛋白質(zhì) 即蛋白質(zhì)組（ proteome）為研究對象，分析細(xì)胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì) 組成 、 表達(dá) 水平與 修飾 狀態(tài)；了解蛋白質(zhì)之間的 相互作用 與聯(lián)系；并在整體水平上研究蛋白質(zhì) 調(diào)控 的活動規(guī)律，故又稱為 全景式蛋白質(zhì)表達(dá)譜（ global protein expression profile）分析 。 比較基因組學(xué)（ parative genomics）： 基因組之間比較鑒定，研究生物進(jìn)化，預(yù)測新基因。 病毒基因組有的為 DNA（ DNA病毒 ） ， 有的則為 RNA（ RNA病毒 ） 。RNA研究相關(guān)技術(shù) RNA research related techniques and their application (進(jìn)展 ) 2023級碩士 徐文弟 2023年 9月 28日 導(dǎo)論 ? 再談中心法則 ? RNA世界 ? RNA生物學(xué)功能 ? RNA組學(xué) 再談中心法則 4 中心法則與 RNA 1961年 , 發(fā)現(xiàn) DNA依賴的 RNA聚合酶 1968年 , 提出 RNA是最早的信息分子 1982~1983年 , 發(fā)現(xiàn)核酶 1986年 , 提出“ RNA world” 1947年 , RNA第一次被描述 1968年 , 提出中心法則 中心法則與組學(xué) 基因組： 一種生物擁有的所有遺傳信息的總合 是一個細(xì)胞 （ 或病毒 ） 所承載的全部遺傳信息 ， 它代表了一種生物所具有的全部遺傳信息 。 * 基因組 （ genome） 基因組學(xué)： 包括結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、功能基因組學(xué)和比較基因組學(xué) 基因組學(xué)（ genomics） 是闡明整個基因組的結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及基因之間相互作用的科學(xué)。 轉(zhuǎn)錄組學(xué)： 研究全部 RNA的表達(dá)及功能 ? 轉(zhuǎn)錄組（ transcriptome） 指生命單元（通常是一種細(xì)胞）所能轉(zhuǎn)錄出來的所有 RNA——包括指導(dǎo)蛋白質(zhì)翻譯的 mRNA和非編碼 RNA (noncoding RNA, ncRNA)的總和。 蛋白質(zhì)組學(xué)（ proteomics） 蛋白質(zhì)組： 全景式蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析 蛋白質(zhì)組學(xué)的中心任務(wù)： 研究細(xì)胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)組成及其活動規(guī)律 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究內(nèi)容： 一、蛋白質(zhì)組表達(dá)模式的研究，即結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)（ structural proteomics） 二、蛋白質(zhì)組功能模式的研究，即功能蛋白質(zhì)組學(xué)（ functional proteomics） 蛋白質(zhì)組學(xué)的主要任務(wù)： 蛋白質(zhì)鑒定： 可以利用一維電泳和二維電泳并結(jié)合生物質(zhì)譜、Western印跡、蛋白質(zhì)芯片等技術(shù)，對蛋白質(zhì)進(jìn)行全面的鑒定研究。 – 以藥物效應(yīng)及安全性為目標(biāo)，研究各種基因突變與藥效及安全性的關(guān)系，是研究高效、特效藥物的重要途徑，通過它為患者或者特定人群尋找合適的藥物。 代謝組學(xué)： 研究內(nèi)源性代謝物質(zhì)的動態(tài)變化 規(guī)律及與生物過程的聯(lián)系 ? 代謝組學(xué)分為 4個層次： ①代謝物靶標(biāo)分析（ metabolite target analysis） ②代謝譜分析（ metabolic profiling analysis） ③代謝組學(xué)（ metabonomics） ④代謝指紋分析（ metabolic fingerprinting analysis） ? 代謝組學(xué)研究對象： 生物體液 —— 血樣、尿樣等 完整的組織樣品、組織提取液和細(xì)胞培養(yǎng)液 （一）代謝組學(xué)的任務(wù)： 分析生物 /細(xì)胞代謝產(chǎn)物的全貌 主要的分析工具 ① 核磁共振 （ nuclear magic resonance， NMR）： 氫譜（ 1HNMR）、碳譜（ 13CNMR）及磷譜（ 31PNMR）。 ? 疾病 → 機(jī)體病理生理過程變化 → 代謝產(chǎn)物的改變 → 比較分析與正常人的代謝產(chǎn)物差異 → 發(fā)現(xiàn)和篩選出疾病新的生物標(biāo)記物 → 對相關(guān)疾病作出早期預(yù)警 → 發(fā)展新的有效的疾病診斷方法。大量非編碼 RNA的發(fā)現(xiàn)及其生物學(xué)功能多樣性被揭示。 ? 1986年， Walter Gilbert 創(chuàng)造了“ RNA world”這個名詞，用于描述其提出的關(guān)于分子起源的假說：在生命進(jìn)化的早期存在一個只有 RNA，沒有 DNA和蛋白質(zhì)的世界； RNA既是遺傳信息載體又具有酶的催化功能，它們催化自身的合成。 ? RNA的種類 、 大小和結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)比 DNA表現(xiàn)出多樣性 。 RNA應(yīng)用相關(guān)技術(shù)則包括用于生產(chǎn)其他產(chǎn)品的 RNA技術(shù)和直接用于藥物開發(fā)的 RNA技術(shù) 。 1893 年， Kossel 提出，酵母來源的核酸含有核糖， RNA 的研究正式開始。 RNA可利用體外轉(zhuǎn)錄體系合成 利用 體外轉(zhuǎn)錄體系 （ in vitro transcription system） 合成RNA是分子生物學(xué)常用技術(shù) 。 目前主要有兩種： 一是利用 電泳 根據(jù)分子大小分離； 二是利用不同濃度的 有機(jī)溶劑的沉降 或 吸附效率 不同分離。細(xì)胞裂解之后要看不見顆粒狀物質(zhì)（結(jié)締組織和骨除外）。 ，因此制備 RNA時必須戴手套 2. RNase的又一污染源是取液器。（ DEPC二乙基焦碳酸酯為活性很強(qiáng)的劇毒物，須在通風(fēng)櫥中小心使用） 將待處理的塑料制品放入一個可以高溫滅菌的容器中，注入DEPCH2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通風(fēng)柜中37℃ 或室溫下處理過夜 將 DEPCH2O小心倒入廢液瓶中，將裝有 DEPCH2O處理過的塑料制品的容器以鋁箔封口，高溫高壓蒸汽滅菌至少 30分鐘。（此時 RNA是不溶解的） 9. 8000rpm，室溫離心 10min ，防止 RNA沉淀丟失 3~5分鐘，或放在室溫下使乙醇完全揮發(fā)掉 30μlDEPCH2O溶解。 近年來發(fā)展的 CAGE(cap analysis gene expression)，SAGE(serial analysis of gene expression)等技術(shù)可以實(shí)現(xiàn) RNA 末端大規(guī)模鑒定。 目前有關(guān)小 RNA豐度測定主要是利用 改進(jìn)反轉(zhuǎn)錄PCR 技術(shù) ，常見有三種方案： 一、在兩端加 RNA 接頭 二、通過在 3‘ 端加 polyA 尾模擬 mRNA 三、利用 stemloop 反轉(zhuǎn)錄引物技術(shù) 前兩者同樣可用于小 RNA 文庫的構(gòu)建，之后通過測序，可以獲得小 RNA 的序列信息，在大規(guī)模實(shí)驗(yàn)的條件下，根據(jù)獲得的克隆頻數(shù)也能分析相應(yīng)的表達(dá)水平。 小 RNA的克隆和鑒定 小鼠腦 組織勻漿 總 RNA 8%PAGE 回收 50110nt(fractionI)和 110500nt(fractionII) Poly(A)聚合酶加 C尾 cDNA pSPORT1 PCR 高密度陣列 雜交除去高豐度、已知的小 RNA 未雜交的 cDNA測序 詳見： 蛋白質(zhì) RNA復(fù)合物分離法 分離蛋白質(zhì) RNA復(fù)合物，除去蛋白質(zhì)，純化 RNA分子，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，克隆，測序，結(jié)果分析。 RNA 足跡 、 修飾干擾分析 和 RNP中寡核苷酸靶向的RNase H 切割 保護(hù)實(shí)驗(yàn) 技術(shù)也常用于鑒定重要的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。 二是利用各種文庫篩選技術(shù)，如酵母三雜交技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、核糖體展示技術(shù)、抑制細(xì)菌轉(zhuǎn)錄終止檢測技術(shù)、 Northwestern 技術(shù)等篩選 RNA結(jié)合蛋白。 RNA 高級結(jié)構(gòu)研究技術(shù) RNA 高級結(jié)構(gòu)、 RNA與其結(jié)合蛋白的高級結(jié)構(gòu)是RNA研究的重要組成部分。） 其他 RNA研究相關(guān)技術(shù) 在 RNA的研究中不可避免的會遇到 RNA降解問題，這就需要利用 RNA保存技術(shù) ，這是 RNA研究中最基礎(chǔ)也是最重要的技術(shù)之一。 直到 20世紀(jì) 80 年代末， 核酶專利 的出現(xiàn)使得 RNA 應(yīng)用技術(shù)的研究迅速升溫。 1984 年， Izant 和 Weintraub 等首次提出反義核酸技術(shù)(antisense technology)的概念。 第一個反義核酸藥物 (VitravenekTM)已經(jīng)進(jìn)入商業(yè)市場，還有多種反義核酸進(jìn)入 III 期臨床試驗(yàn)。 核酶通過催化轉(zhuǎn)磷酸酯和磷酸二酯鍵水解反應(yīng)參與RNA自身剪切、加工過程。 脫氧核酶 (deoxyribozyme) 是近年來發(fā)現(xiàn)的一類具有催化活性的單鏈 DNA分子。 RNA底物通過二個莖環(huán)結(jié)合到核酶上，切割位點(diǎn)由一個非配對