【正文】 ，使 細胞在微載體表面附著并呈單層生長繁殖 ，通過持續(xù)攪動使微載體始終保持懸浮狀態(tài) 的培養(yǎng)方法。 微載體使利用生物反應(yīng)器進行動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)成為可能，既能 滿足動物細胞的貼壁要求 ，又能充分 利用生物反應(yīng)器的內(nèi)部空間 。 良好微載體的特點： 好的生物相容性：無毒無害； 好的黏附性：適于細胞附著、伸展和增殖，一般帶正電荷； 大的比表面積：顆粒均勻，孔徑均一； 良好的傳質(zhì)性能； 強的機械性能：保護細胞、重復(fù)利用； 好的熱穩(wěn)定性：適合高壓蒸汽滅菌。 動物細胞貼壁生長的主要環(huán)節(jié)有哪些？ 潛伏期 ： （ 1）游離期：接種的細胞在培養(yǎng)液中呈 懸浮狀態(tài) 。 （ 2）吸附期：不同類型的細胞 貼壁 時間有所差異。 對數(shù)生長期 ：懸浮細胞貼壁后經(jīng)過一段停滯后開始分裂。隨著 細胞數(shù)量增多 ，細胞間開始接觸并連接成片，出現(xiàn) 接觸性抑制 。 停滯期 ：細胞長滿載體表面，隨著營養(yǎng)物消耗和代謝物積累， 密度抑制現(xiàn)象 出現(xiàn)，細胞開始退化。如不 及時傳代培養(yǎng) ，細胞脫落死亡。 知識點回顧 微載體培養(yǎng)的操作過程： 微載體培養(yǎng)動物細胞也經(jīng)過以上四步。大致可以分為五個階段，即 培養(yǎng)初期階段、黏附貼壁階段、維持培養(yǎng)階段、細胞收獲階段、微載體培養(yǎng)的放大階段 。 培養(yǎng)初期階段： 保證培養(yǎng)基與微載體處于穩(wěn)定的 pＨ和溫度，對數(shù)生長期細胞接種至 1/3體積的培養(yǎng)基中。 黏附貼壁階段： 緩慢加入培養(yǎng)液至工作體積，增加攪拌速度保證完全均質(zhì)混合。 維持培養(yǎng)階段： 隨細胞增殖，微球變重，增加攪拌速率。經(jīng)過 3天左右，培養(yǎng)液呈酸性，需換液。 細胞收獲階段： 排干培養(yǎng)液，緩沖液漂洗 1次，加入酶，快速攪拌，解離收集細胞及其產(chǎn)品。 微載體培養(yǎng)的放大階段： 增加微載體的含量或培養(yǎng)體積進行放大。 微載體培養(yǎng)的優(yōu)點： 表面積／體積大 ，單位體積培養(yǎng)液的 細胞產(chǎn)率高 。 把 懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)融合 ， 兼有兩者的優(yōu)點。 可用簡單的顯微鏡 觀察細胞 在微珠表面的 生長情況 。 培養(yǎng)系統(tǒng) 占地面積和空間小 ； 勞動強度小 ； 放大容易 ，使大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞成為可能。 接種與收獲方便 ，可循環(huán)、連續(xù)收獲與培養(yǎng)， 培養(yǎng)基 利用率較高 。 微載體培養(yǎng)的缺點： 細胞生長在微載體表面，培養(yǎng)過程中連續(xù)攪拌會 損傷微載體表面的細胞 ，而且培養(yǎng)后期 細胞容易從微載體上脫落下來 。 為克服傳統(tǒng)的實心微載體的不足，現(xiàn)開發(fā)出 大孔微載體 。大孔微載體內(nèi)部具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的小孔，細胞在其內(nèi)部生長，保證細胞充分的生長空間，使細胞免受機械損傷，增加細胞貼壁的穩(wěn)定性。 固定化培養(yǎng) 將 動物細胞 與 水不溶性載體 結(jié)合起來再進行培養(yǎng)的方法。 具有 細胞生長密度高 ， 抗剪切力和抗污染能力強等優(yōu)點，細胞易與產(chǎn)物分開，有 利于產(chǎn)物分離純化 。 在動物細胞培養(yǎng)中要考慮使用較溫和的固定化方法，如 吸附培養(yǎng)法、包埋培養(yǎng)法和微囊培養(yǎng)法 。 （二）大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式 分批式培養(yǎng) 流加式培養(yǎng) 半連續(xù)式培養(yǎng) 連續(xù)式培養(yǎng) 灌注式培養(yǎng) 分批式培養(yǎng) 將細胞和培養(yǎng)液 一次性 轉(zhuǎn)入生物反應(yīng)器內(nèi)，培養(yǎng)過程中 體積不變 ，不添加其他成分，待細胞增長和產(chǎn)物形成積累到適當?shù)臅r間， 一次性收獲細胞、產(chǎn)物、培養(yǎng)基 。 周期為 3~5d， 細胞經(jīng)歷對數(shù)生長期，密度達到最高值后，由于營養(yǎng)物質(zhì)耗盡或代謝產(chǎn)物累積，細胞進入衰亡期。 收獲產(chǎn)物在細胞快要死亡或已經(jīng)死亡后進行。 流加式培養(yǎng) 將 終體積 1/3～ 1/2的培養(yǎng)液裝入反應(yīng)器中，適宜條件下接種細胞，培養(yǎng)過程中 流加濃縮的營養(yǎng)物或培養(yǎng)液 ，使細胞持續(xù)生長至 較高密度 、目標產(chǎn)品達到 較高水平 。 采用 機械攪拌式生物反應(yīng)器 系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)細胞或以懸浮微載體培養(yǎng)貼壁細胞。 流加式培養(yǎng) 關(guān)鍵技術(shù)是在 細胞指數(shù)生長后期進入衰退期之前添加高濃度的營養(yǎng)物質(zhì)，可添加一次，也可多次?？傮w原則是 維持相對穩(wěn)定的細胞生長環(huán)境 ，營養(yǎng)成分既不因過剩產(chǎn)生大量的代謝副產(chǎn)物造成營養(yǎng)利用率下降，也不因缺乏導(dǎo)致細胞生長受到抑制或死亡。 半連續(xù)式培養(yǎng) 也稱為重復(fù)批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)。在細胞增長和產(chǎn)物形成過程中，每間隔一段時間 取出部分培養(yǎng)物 ，再用 新培養(yǎng)液補足到原有體積 ，維持反應(yīng)器內(nèi)總體積不變。 特點 ：（ 1）培養(yǎng)物的體積逐步增加； （ 2）可進行多次收獲； （ 3）細胞可持續(xù)指數(shù)生長，保持產(chǎn)物和細胞在較高的濃度水平，培養(yǎng)過程可延續(xù)很長時間。 連續(xù)式培養(yǎng) 將細胞接種于一定體積的培養(yǎng)基，細胞達最大密度之前，以 一定速度連續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基 ，同時含有細胞的 培養(yǎng)物以相同的速度連續(xù)從反應(yīng)器流出 ，以保持培養(yǎng)體積恒定。 細胞可在 穩(wěn)定狀態(tài)下生長 ，環(huán)境條件如營養(yǎng)物質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度、 pH可恒定，可 有效延長細胞的對數(shù)生長期 。 灌注式培養(yǎng) 細胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細胞增長和產(chǎn)物形成過程中，不斷將 部分培養(yǎng)基取出 ，同時連續(xù) 不斷地灌注新培養(yǎng)基 。取出部分培養(yǎng)基時， 絕大部分細胞通過細胞截流裝置保留在反應(yīng)器內(nèi) 。 灌注培養(yǎng)的優(yōu)點 細胞截流系統(tǒng)使細胞留在反應(yīng)器內(nèi)，維持較高細胞密度，提高產(chǎn)品的產(chǎn)量； 細胞穩(wěn)定處在好的營養(yǎng)環(huán)境中，有害代謝物積累少； 反應(yīng)速率容易控制，培養(yǎng)周期較長，可提高生產(chǎn)率，目標產(chǎn)品回收率高； 可連續(xù)性收獲產(chǎn)品。 本章小結(jié) 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的工藝流程主要包括哪些步驟？ 微載體的選擇有何要求？ 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)有幾種操作方式？各自具有哪些特點？