細(xì)胞工程基本技術(shù)ppt課件-資料下載頁
2024-09-20 20:20本頁面
【正文】 內(nèi)側(cè)；而在細(xì)胞凋亡的早期， PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面。因此，PS基團(tuán)位置的改變，可作為凋亡細(xì)胞的一種標(biāo)志。膜聯(lián)蛋白中的 Annexin— V，即錨定蛋白，是一種Ca依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與 PS具有高親和力。將Annexin— V進(jìn)行熒光素 (FITC、 PE)標(biāo)記，以標(biāo)記的 Annexin— V處理細(xì)胞懸液，利用流式細(xì)胞儀 (或熒光顯微鏡 )即可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。若將Annexin— V和熒光素 PI匹配使用，可以將凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞區(qū)分開來： Annexin— V為陽性， PI為陰性的細(xì)胞即為凋亡細(xì)胞；雙染色細(xì)胞或是壞死細(xì)胞，或是凋亡晚期細(xì)胞 (歸因于次級壞死 )。 DNA片段化檢測 DNA 電泳圖譜法 細(xì)胞凋亡時主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮，染色質(zhì) DNA 在核小體單位之間的連接處斷裂，形成180～ 200 bp長的 DNA片段或整數(shù)倍的寡核苷酸片段。凋亡細(xì)胞經(jīng)處理后，采用常規(guī)方法分離提純 DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色，在凋亡細(xì)胞群中可觀察到典型的梯形電泳圖譜，而壞死細(xì)胞電泳后呈模糊的涂片狀。 ELlSA 法分析組蛋白 ? 細(xì)胞發(fā)生凋亡時， Ca 、 Mg 依賴性內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，在核小體連接區(qū)切開雙鏈 DNA，產(chǎn)生帶有單個或寡聚核小體的 DNA片段。而核小體 DNA 與中心組蛋白 H z A、 H。 B、 Hs和 H 緊密結(jié)合，又可以防止核酸內(nèi)切酶的切割作用，故產(chǎn)生的 DNA 片段是 180～ 200bp的整數(shù)倍，在凋亡細(xì)胞的胞漿中出現(xiàn)核小體或寡聚核小體?]。該法是利用“夾心定量酶標(biāo)免疫測定法”的原理，用抗組蛋白一生物素和抗 DNA一過氧化物酶 (POD)分別結(jié)合到核小體的組蛋白和DNA ? 成分上，洗滌除去未結(jié)合的抗體后，加入 POD底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，通過酶標(biāo)測定儀分析，即可定量反映細(xì)胞凋亡的水平。該方法的優(yōu)點(diǎn)是：靈敏度高，操作快捷，無放射性同位素污染，可定量測定細(xì)胞凋亡，無需預(yù)先標(biāo)記細(xì)胞，所用抗體不具有種屬特異性， POD標(biāo)記的抗 DNA抗體可與單鏈和雙鏈的 DNA起反應(yīng)?？贵w夾心酶聯(lián)免疫分析法可以測定核小體單體和寡聚核小體，因而可以用于許多不同的培養(yǎng)細(xì)胞株或動物組織細(xì)胞的凋亡檢測 ]。 DNA 末端標(biāo)記法 ? 1993年 Wijsman等提出了 DNA 片段末端標(biāo)記法， 1994年 Fehsel等。提出了原位缺口轉(zhuǎn)移檢測細(xì)胞凋亡的方法。這些方法的建立特別是由 DNA片段末端標(biāo)記技術(shù)發(fā)展而成的 TUNEL法 [termina deoxy nucleotibyl trans— ferase(TdT)一 mediated dUTP— biotin nick end label— ling，TUNEL labeling 的試劑盒化，使細(xì)胞凋亡的原位檢測在諸多領(lǐng)域的研究中得到廣泛應(yīng)用。 舉例 形態(tài)學(xué)檢測 基本步驟 ? 細(xì)胞培養(yǎng) ? 消化細(xì)胞計數(shù) ? 種植 24孔板（ 1~5X 104 個細(xì)胞 /孔） ? 藥物處理細(xì)胞 ? 用數(shù)碼照相架拍攝形態(tài)照片 ? 吸走培養(yǎng)基， PBS洗滌一次， 95%乙醇固定20min ? 吸走乙醇每孔加 200ul 丫啶橙避光 10min ? 激光共聚顯微鏡觀測 PS（磷脂酰絲氨酸）外翻檢測 基本步驟 ? 細(xì)胞培養(yǎng) ? 消化細(xì)胞計數(shù) ? 種植 60 mm 培養(yǎng)皿（ 70 X104 個細(xì)胞 /皿） ? 藥物處理細(xì)胞 ? 收細(xì)胞（胰蛋白酶消化 培養(yǎng)基終止） ? 調(diào)整細(xì)胞密度為 1X106/ ml ? 取 500ul 加入 ul Annexin VFITC 室溫避光處理15min ? 400g 離心 10min ? 去上清， 500ul PBS重懸 , 加 ul 10mg/mlPI ? 流式細(xì)胞儀或激光共聚焦檢測檢測 Treatment Type of cell death ( % of total cells) early apoptosis late apoptosis necrosis Control 177。 177。 177。 TV(15 ) 181。M 24h 177。 177。 177。 48h 177。 177。 177。 72h 177。 177。 177。 96h 177。 177。 177。 十、細(xì)胞培養(yǎng)物的保存和復(fù)蘇 （緩凍速溶） 保存：低溫冷凍保存法 冷凍保護(hù)液：含 10%血清的培養(yǎng)液中加 10%的甘油或%— 10%的二甲基亞砜（ DMSD） 首先將細(xì)胞放入冷凍保護(hù)液進(jìn)行預(yù)冷卻，然后按 1 ml/安瓶裝瓶封口。再放入慢凍機(jī)按每分鐘下降 1 ℃ 的速度緩慢冷凍至 25 ℃ ，最后放入液氮。 90℃ 可保存 6個月， 196℃ 幾乎可無限期保存。 復(fù)蘇 迅速取出盛冰凍細(xì)胞的安瓶投入 37℃ 水浴中，繼而搖動安瓶使內(nèi)容物在 2060秒內(nèi)完全恢復(fù)懸液狀態(tài)。
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