《細(xì)胞工程基本技術(shù)》ppt課件(文件)
【正文】 ? 平均集落數(shù) ? 集落形成率 = 100% ? 接種的單個(gè)細(xì)胞數(shù) （二）細(xì)胞固定與染色觀察 ? 細(xì)胞固定 ? 細(xì)胞染色 （蘇木精 伊紅）：樣品制備、染細(xì)胞核、染細(xì)胞質(zhì)、脫水、透明和封片。 ? 用于活體染色的染料稱為活體染料或活體染色劑，分為堿性和酸性兩類： ? 堿性活體染料：次甲基藍(lán)、中性紅、詹納斯綠、甲基紫等，常用于體外活體染色。 ? 吖啶橙是一種與 DNA和 RNA都能結(jié)合的熒光染料，在藍(lán)光或紫外光激發(fā)下，原來的活細(xì)胞，其核呈亮綠色，核仁、 RNA呈桔紅色，胞質(zhì)呈淡紅褐色。而活細(xì)胞能及時(shí)排出進(jìn)入細(xì)胞的染料或染料不能進(jìn)入活細(xì)胞，故不著色。 （四）凋亡細(xì)胞的觀察 ? 細(xì)胞凋亡是一種不同于細(xì)胞壞死的細(xì)胞死亡方式，是在一定的生理或病理情況下，機(jī)體為維護(hù)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，通過基因調(diào)控，激活內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶而發(fā)生的細(xì)胞自動(dòng)消亡的過程，亦稱為程序化細(xì)胞死 亡 (programmed cell death， PCD) 形態(tài)學(xué)檢測(cè) ? 光學(xué)顯微鏡觀察 樣品涂片或組織切片經(jīng)常規(guī)處理、 HE染色后，即可放在油鏡下觀察。這種方法適用于對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞懸液的檢測(cè)．組織脫蠟切片經(jīng) RNA酶作用后也可用此法染色觀察。但該法只能定性，不能定量，而且觀察到凋亡小體的幾率也不高，在體內(nèi)試驗(yàn)時(shí)，凋亡小體可能很快被巨噬細(xì)胞吞噬清除，而不易觀察到；此外，用電子顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞凋亡，樣品制備步驟繁瑣、耗時(shí)、昂貴。 凋亡細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的分析與檢測(cè) ? 染料排斥法 除了電子顯微鏡能反映細(xì)胞膜的完整性外，還可用染料排斥法，如臺(tái)盼藍(lán)、 PI等。在正常細(xì)胞膜上，磷脂酰絲氨酸 (phosphatidylserine，PS)位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)；而在細(xì)胞凋亡的早期， PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面。若將Annexin— V和熒光素 PI匹配使用，可以將凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞區(qū)分開來： Annexin— V為陽性， PI為陰性的細(xì)胞即為凋亡細(xì)胞；雙染色細(xì)胞或是壞死細(xì)胞，或是凋亡晚期細(xì)胞 (歸因于次級(jí)壞死 )。而核小體 DNA 與中心組蛋白 H z A、 H。抗體夾心酶聯(lián)免疫分析法可以測(cè)定核小體單體和寡聚核小體，因而可以用于許多不同的培養(yǎng)細(xì)胞株或動(dòng)物組織細(xì)胞的凋亡檢測(cè) ]。 舉例 形態(tài)學(xué)檢測(cè) 基本步驟 ? 細(xì)胞培養(yǎng) ? 消化細(xì)胞計(jì)數(shù) ? 種植 24孔板（ 1~5X 104 個(gè)細(xì)胞 /孔） ? 藥物處理細(xì)胞 ? 用數(shù)碼照相架拍攝形態(tài)照片 ? 吸走培養(yǎng)基， PBS洗滌一次， 95%乙醇固定20min ? 吸走乙醇每孔加 200ul 丫啶橙避光 10min ? 激光共聚顯微鏡觀測(cè) PS（磷脂酰絲氨酸）外翻檢測(cè) 基本步驟 ? 細(xì)胞培養(yǎng) ? 消化細(xì)胞計(jì)數(shù) ? 種植 60 mm 培養(yǎng)皿（ 70 X104 個(gè)細(xì)胞 /皿） ? 藥物處理細(xì)胞 ? 收細(xì)胞（胰蛋白酶消化 培養(yǎng)基終止） ? 調(diào)整細(xì)胞密度為 1X106/ ml ? 取 500ul 加入 ul Annexin VFITC 室溫避光處理15min ? 400g 離心 10min ? 去上清， 500ul PBS重懸 , 加 ul 10mg/mlPI ? 流式細(xì)胞儀或激光共聚焦檢測(cè)檢測(cè) Treatment Type of cell death ( % of total cells) early apoptosis late apoptosis necrosis Control 177。M 24h 177。 177。 177。 十、細(xì)胞培養(yǎng)物的保存和復(fù)蘇 （緩凍速溶） 保存：低溫冷凍保存法 冷凍保護(hù)液：含 10%血清的培養(yǎng)液中加 10%的甘油或%— 10%的二甲基亞砜（ DMSD） 首先將細(xì)胞放入冷凍保護(hù)液進(jìn)行預(yù)冷卻，然后按 1 ml/安瓶裝瓶封口。 。 90℃ 可保存 6個(gè)月， 196℃ 幾乎可無限期保存。 177。 72h 177。 177。 177。提出了原位缺口轉(zhuǎn)移檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法。該法是利用“夾心定量酶標(biāo)免疫測(cè)定法”的原理，用抗組蛋白一生物素和抗 DNA一過氧化物酶 (POD)分別結(jié)合到核小體的組蛋白和DNA ? 成分上，洗滌除去未結(jié)合的抗體后，加入 POD底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，通過酶標(biāo)測(cè)定儀分析，即可定量反映細(xì)胞凋亡的水平。凋亡細(xì)胞經(jīng)處理后，采用常規(guī)方法分離提純 DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色，在凋亡細(xì)胞群中可觀察到典型的梯形電泳圖譜，而壞死細(xì)胞電泳后呈模糊的涂片狀。膜聯(lián)蛋白中的 Annexin— V，即錨定蛋白，是一種Ca依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與 PS具有高親和力。但在體外培養(yǎng)的細(xì)胞最終也會(huì)發(fā)生繼發(fā)性壞死，因此，此法不能單獨(dú)用來判斷 Ap細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。該方法能用于細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析
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