【正文】 碼區(qū)及 3’ 末端區(qū)相連接 ) 用 ExoⅢ 外切核酸酶處理 得到 5’ 端各有不同缺失長度的融合基因 轉(zhuǎn)化植物 獲得含有上述不同缺失長度融合基因突變體的植株 用組織化學(xué)方法或其他方法 ,分析基因的 5’ 上游區(qū)缺失到什么部位就不能使 報告基因表達 ,或失去正確時空表達專一性 ,或失去對脅迫因素的應(yīng)答能力。 找到調(diào)控元件存在的區(qū)域 從該區(qū)域的 5’ 端作小范圍的缺失突變 ,或從該區(qū)域中間的不同部位造成缺 失突變 找出調(diào)控元件存在的準(zhǔn)確位點 人工合成此位點內(nèi)的核苷酸序列 ,或?qū)⒋诵蛄兄械膫€別核苷酸調(diào)換 ,或?qū)⑦@段 序列與突變后的序列分別連接在基礎(chǔ)啟動子上游 檢測它們是否能調(diào)節(jié)報告基因的表達 (transacting factor) ● 反式作用因子是指那些結(jié)合到順式作用元件上特 異 DNA序列，并相互作用而實現(xiàn)其調(diào)節(jié)效應(yīng)的 蛋白質(zhì) 因子 ，它們可以增強或阻遏基因的表達 ,或者決定著基 因表達的組織與發(fā)育階段專一性。 主要的反式作用因子有： ① 基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子 ，是與 TATA盒 /啟動子結(jié)合的蛋白質(zhì)因子； ②轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 ，是一些與啟動子上游序列結(jié)合的蛋白質(zhì)因子； ③誘導(dǎo)基因表達的轉(zhuǎn)錄因子 ，它是與基因的啟動子或增強子區(qū)內(nèi)一小段短的 DNA序列結(jié)合從而完成該基因的誘導(dǎo)表達過程蛋白質(zhì)因子； ④細胞專一基因表達的轉(zhuǎn)錄因子 ，這些因子通常都在某一特定組織中合成或激活并誘發(fā)細胞專一基因的轉(zhuǎn)錄 。 ● 轉(zhuǎn)錄因子的作用方式 研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子通常由 DNA結(jié)合區(qū) 和 轉(zhuǎn)錄激活 區(qū) 兩個功能區(qū)組成。 轉(zhuǎn)錄因子 DNA結(jié)合區(qū) 轉(zhuǎn)錄激活區(qū) 螺旋 轉(zhuǎn)角 螺旋結(jié)構(gòu) , 鋅指 (Zinc finger)結(jié)構(gòu) 亮氨酸拉鏈 (leucine zipper)結(jié)構(gòu) 酸性功能區(qū) 谷氨酰胺豐富功能區(qū) 脯氨酸豐富功能區(qū) (1) DNA結(jié)合區(qū)的類型 ① 螺旋 轉(zhuǎn)角 螺旋結(jié)構(gòu) 由兩個的 α螺旋通過 折疊相互 垂直連接構(gòu)成：兩個的 α螺旋 中的一個通過與磷酸作用，與 DNA形成非特異的結(jié)合；另一 個叫 識別 螺旋，與 DNA上的堿 基序列特異的接觸結(jié)合。 左圖 右圖 ② 鋅指 (Zinc finger)結(jié)構(gòu) 由多個重復(fù)的結(jié)構(gòu)組成，每個 分子中結(jié)合有 711個鋅原子， 每 2個半胱氨酸（ Cys）和 2個 組氨酸（ His）與一個 Zn原子結(jié) 合形成鋅指，一個完整的分子 可形成多個“指頭”，這有利于 DNA結(jié)合。 由亮氨酸豐富區(qū)組成兩個 α螺旋：每 7個氨基酸就有 1個亮氨酸，螺旋中每兩圈出現(xiàn)一個亮氨酸；二個蛋白質(zhì)因子的 α螺旋通過亮氨酸的疏水作用形成一個拉鏈（二聚體） ,其作用只是使兩個蛋質(zhì)分子能形成雙體，從而有助于堿性功能區(qū)與 DNA 結(jié)合。 ③ 亮氨酸拉鏈(leucine zipper)結(jié)構(gòu) (2)激活功能區(qū) 轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活功能區(qū)一般 由 30個到 150個氨基酸組成，其結(jié) 構(gòu)主要有三種類型： 酸性功能區(qū)、 谷氨酰胺豐富功能區(qū)和脯氨酸豐富 功能區(qū)。其作 用機制可能有兩種模 式： 一是激活功能區(qū)直接與 RNA聚合 酶相互作用，從而提高其活性。 二是激活功能區(qū)與其他轉(zhuǎn)錄因子 （ TFⅡD ）作用，然后再作用于 RNA聚合酶。 (1) 細胞分裂素對基因表達的調(diào)控 ● 細胞分裂素能夠直接調(diào)控細胞核基因的活性： 例如 ，從豌豆染色質(zhì)中分離到一種細胞分裂素受 體蛋白 ,在 RNA合成實驗體系中加入這種蛋白質(zhì)及細 胞分裂素時可以使 RNA合成速度增加 20%到 50% （細胞分裂素受體蛋白能作為一種反式作用因子識 別 DNA中某些基因的順式作用元件）。 ● 細胞分裂素可調(diào)控蛋白質(zhì)的磷酸化； ● 細胞分裂素還可調(diào)控蛋白質(zhì)的翻譯： 例如 ， 一種稱為 異戊間二烯腺嘌呤 (ipA)細胞分裂 素存在于 tRNA分子的反密碼子鄰近處。 實驗證 實， ipA具有是維持密碼和反密碼子之間的相互協(xié)調(diào) 的作用。 A G T A A i p 反密碼子 tRNA (2)生長素對基因表達的調(diào)控 ● 植物生長素能誘導(dǎo) mRNA的合成，而且能調(diào)控細胞內(nèi) mRNA的含量水平： ◆ 已克隆出幾個受植物生長素誘導(dǎo)的 mRNA的 cDNA ◆ 2,4D可以誘導(dǎo)苜蓿體細胞胚胎發(fā)生中編碼富含脯氨酸的小分子蛋白質(zhì)基因 (MsPRP5)的表達；用 100 μmol/L 的 2,4D處理愈傷組織 20min，其 MsPRPS 的mRNA量開始增加 ,處理 2448h， mRNA的量達到峰值。 ● 生長素受體在 基因表達調(diào)控中的作用方式： 激素受體是一類特殊的識別蛋白 , 生長素先與靶 細胞膜或細胞質(zhì)中的激素受體結(jié)合 ,形成 “ 生長素 受體 ” 復(fù)合物，進而轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，復(fù)合物特異 性、高親和地與 DNA上特定序列相互作用（激活反 式作用因子），形成新的 RNA，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控 基因表達： (3) ABA對基因表達的調(diào)控 ABA對植物的生理及發(fā)育過程都有調(diào)控作用，包括胚胎形態(tài) 發(fā)生 ,氣孔開閉及植物對滲透壓逆境的反應(yīng)。在體細胞胚胎發(fā)生 過程中： ● ABA能誘導(dǎo)一些特異性蛋白質(zhì)的合成： 如種子貯藏蛋白等； ● 調(diào)節(jié)某些科植物胚胎發(fā)生特異性基因的表達： 在轉(zhuǎn)化的水稻原生質(zhì)體中，用 ABA誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)入水稻的小麥胚 胎發(fā)生相關(guān)基因啟動子 (Em)的轉(zhuǎn)錄。 (1)蛋白質(zhì)的磷酸化影響蛋白質(zhì)因子的運轉(zhuǎn)： ● 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄需要通過核膜進入核內(nèi)，如果阻遏蛋白的磷酸化，則使其產(chǎn)生變構(gòu)作用而失去運轉(zhuǎn)、結(jié)合與調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄表達的能力。 (2)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合 DNA的能力： ● CMyc是一種核磷酸化蛋白 ,它被磷酸化后就失去 結(jié)合 DNA的能力 ,不能激活基因的轉(zhuǎn)錄。推測磷酸化可 導(dǎo)致構(gòu)象變化 ,促進 N端的折疊 ,使 DNA的結(jié)合被遮蓋。 (3)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活功能 ： 133位絲氨酸 CREB轉(zhuǎn)錄因子 133位絲氨酸 磷酸化 CREB轉(zhuǎn)錄因子 蛋白質(zhì)激酶 A cAMP mRNA 激活功能區(qū) 5. DNA的甲基化對基因表達的調(diào)控作用 (1) DNA甲基化 (methylation)的基本特點： ● DNA甲基化是基因組的特征，細胞內(nèi)甲基化過程 發(fā)生在 DNA合成以后，通常以半保留方式進行 DNA 修 飾，即雙鏈 DNA中僅對新合成鏈的對應(yīng)位點 胞嘧啶 殘基 進行甲基化修飾 :特別是在鳥嘌呤 (G)旁邊的 C 上： 539。GCm3‘ （ CPG）。 (2)特異 DNA序列的甲基化降低基因表達活性： ● 不活動或持續(xù)失活的基因甲基化程度較高 ,活躍 的或持續(xù)表達的基因常是低甲基化的；而具有組織 特異性表達的基因 5’ 端上游常呈低甲基化狀態(tài)。 ● 在植物體細胞胚發(fā)生早期，細胞中的甲基化程 度很低，隨著胚的發(fā)育成熟，甲基化程度升高。 ● 培養(yǎng)細胞的分化率一般需要誘導(dǎo)，就是因為其甲基化程度較高，抑制了培養(yǎng)細胞中胚性相關(guān)基因的表達； 而通過激素、光溫條件等條件的誘導(dǎo)，降低 DNA甲基化程度，胚性相關(guān)基因才能表達，胚性細胞才能形成并進一步發(fā)育。 ● 到一定發(fā)育階段時， DNA甲基化水平又逐漸升高，胚性相關(guān)基因的表達由處于不活躍狀態(tài)，使植株發(fā)育成熟。 原因 : ◆ 甲基化影響 DNA與蛋白質(zhì)的相互識別與作用；◆ 甲基化影響 DNA的構(gòu)象。 (3) 2,4D具有促進 DNA甲基化的作用 ● Loschiava等觀察到當(dāng)胡蘿卜懸浮培養(yǎng)物在含高濃度的 2,4D的培養(yǎng)條件下 ,其核 DNA的甲基化從 16%增加到 45%； ● 當(dāng)除去 2,4D并降低細胞密度時 ,核 DNA便去甲基化。因此 ,激活了相應(yīng)基因的表達。 ● 這可以解釋，為什么在植物體細胞胚發(fā)生中，許多材料的愈傷組織誘導(dǎo)需要高濃度的 2,4D，而體細胞胚的發(fā)生則必需降低或去除 2,4D。 思考題： 1． 花粉小孢子離體發(fā)育的基本途徑及其主要特點？ 2. 體細胞離體再生的基本類型及特點？ 3．胚性細胞分裂不同步性的可能原因是什么 ?有什么克服的方法 ? 4．體細胞胚胎發(fā)生的基本過程及其特點？ 5. 花粉小孢子離體發(fā)育的 A、 B、 C途徑及其特點？ ? 7．胚性細胞形成過程中主要的生化變化 ? 8．體細胞胚起源的普遍觀點是什么 ?有何特點 ? 9．體細胞轉(zhuǎn)化為胚性細胞的漸變理論的基本觀點是什么 ? 10．為什么體細胞胚胎發(fā)生過程中易發(fā)生遺傳變異 ,而且具有普遍性 ? 11．影響體細胞胚胎發(fā)生變異性的主要因素是什么 ? 12．參與腋芽和分生組織發(fā)育的基因的類型與種類？ 13. KNOX基因的生物學(xué)與莖尖組織發(fā)育的關(guān)系？ ? 13. 何謂螺旋 轉(zhuǎn)角 螺旋、鋅指和亮氨酸拉鏈？ 14. 蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化對基因轉(zhuǎn)錄有和調(diào)節(jié)作用 ? 15. 體細胞胚發(fā)生中 DNA的甲基化對基因表達有何調(diào)控作用 ? 被子植物生活史