【正文】 壞胚胎。 受倫理譴責(zé) 。） ? 突破四：采用基因工程的手段來(lái)研究細(xì)胞工程，提供了一種新的思路和方法，也是研究發(fā)育生物學(xué)、疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制、基因與蛋白質(zhì)功能分析等的十分重要的實(shí)用模型 * 第 3章 細(xì)胞工程 124 缺陷 ? 效率低下： 5K到 10K個(gè)細(xì)胞才能有一個(gè) iPS細(xì)胞系 ? 載體的安全性：采用了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的病毒載體，病毒載體本身的序列都有可能致瘤 ? 候選基因的安全性： cmyc是一種轉(zhuǎn)錄因子，也是一種可使細(xì)胞無(wú)限增殖，獲永生化功能，促進(jìn)細(xì)胞分裂的基因 ， 與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān) ? 候選基因的范圍：各自的 4個(gè)候選基因有兩個(gè)重復(fù)，可見(jiàn)還可進(jìn)一步縮小范圍 ? 重編程的分子機(jī)制：尚不清楚 ? 不同基因誘導(dǎo)獲得的 iPS，再生出特定組織能力也有所不同 * 第 3章 細(xì)胞工程 125 2022年：日本擬建 iPS細(xì)胞庫(kù) ? 山中伸彌 5月 11日在京都舉行的誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（ iPS細(xì)胞）國(guó)際研討會(huì)上透露了日本建 iPS細(xì)胞庫(kù)的計(jì)劃。日本規(guī)劃中的細(xì)胞庫(kù)將儲(chǔ)存 iPS細(xì)胞以及由其分化出來(lái)的各種臟器細(xì)胞。 第 3章 細(xì)胞工程 126 ? 2022年 9月 13日：日本京都大學(xué)日前宣布，該校教授山中伸彌開(kāi)發(fā)的誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（ iPS細(xì)胞）培養(yǎng)方法已被日本特許廳（相當(dāng)于專利局）授予專利，成為世界首個(gè)獲得批準(zhǔn)的 iPS細(xì)胞相關(guān)專利。 ? 獲批的專利內(nèi)容是“將４種基因植入普通體細(xì)胞，可使體細(xì)胞轉(zhuǎn)變成擁有分化為各種組織細(xì)胞能力的 iPS細(xì)胞”，專利有效期到 2026年 12月。 ? 京都大學(xué)希望通過(guò)在日本國(guó)內(nèi)獲得專利，造成既定事實(shí)，從而在與歐美研究人員的競(jìng)爭(zhēng)中搶得先機(jī)。 ? 這是世界首個(gè) iPS細(xì)胞相關(guān)專利，但鑒于人類 iPS細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)鼠 iPS細(xì)胞的培養(yǎng)方法差別顯著，在再生醫(yī)療領(lǐng)域備受期待的人類 iPS細(xì)胞專利能否獲得批準(zhǔn)，前景尚不明朗。 2022年：日本授予 iPS技術(shù)專利 第 3章 細(xì)胞工程 127 2022年：歐洲首個(gè) iPS專利英國(guó)獲批 ? 2022年 1月 12日英國(guó)知識(shí)產(chǎn)權(quán)辦公室授予 iPierian公司（ 2022年 7月 iZumi Bio, Pierian,） iPS技術(shù)專利權(quán)，他們認(rèn)為神戶的一位科學(xué)家Kazuhiro Sakurada才是 iPS的創(chuàng)始人，山中伸彌不是，而Kazuhiro Sakurada早期在 iZumi Bio,務(wù)。早在 2022年 iPierian公司便對(duì)外宣稱，他們?cè)摣@得 iPS的相關(guān)專利。 ? 山中伸彌曾在加州大學(xué)的一個(gè)實(shí)驗(yàn)室做 iPS試驗(yàn)，試驗(yàn)的經(jīng)費(fèi)來(lái)自 iPierian公司。 第 3章 細(xì)胞工程 128 進(jìn)展 ? 候選基因的變化 ： 3個(gè)基因（小鼠）；或者 Oct4 加上 Klf4或 cMyc （成年小鼠神經(jīng)干細(xì)胞）；單個(gè)基因 —— Oct4(小鼠神經(jīng)干細(xì)胞 )； microRNA和三種基因（ miR2913p, miR294， miR295 和 Oct4, Sox2, Klf4） （鼠）、化學(xué)小分子 ,?? ? 細(xì)胞來(lái)源的拓展 ：成熟 B細(xì)胞（小鼠），老年 ALS患者皮膚（人類）；兒童 SMA患者皮膚（人類）， ?? ? 載體的改變 ：藥物 慢病毒系統(tǒng)（人類），腺病毒載體（小鼠），轉(zhuǎn)座子（人類），質(zhì)粒（小鼠；人），無(wú)病毒載體 ? 誘導(dǎo)效率的提高 ：兩種因子（人類）；阻斷 p53基因途徑；低氧環(huán)境（人類）； ? 安全性研究 第 3章 細(xì)胞工程 129 進(jìn)展 1：去除 cmyc基因之后，剩下的 3個(gè)基因仍然能誘導(dǎo)出 iPS細(xì)胞 ? （山中伸彌， 2022年 6月 14日，美國(guó)費(fèi)城，國(guó)際干細(xì)胞研究協(xié)會(huì)會(huì)議 ） ? 三種不同類型的嵌合小鼠，都是由小鼠 iPS細(xì)胞進(jìn)一步得來(lái)的：第一種類型的小鼠是在表皮細(xì)胞中導(dǎo)入四種轉(zhuǎn)錄子的基因副本（ Oct3/4， Sox2， cMyc和 Klf4）后得到的；第二類中沒(méi)有導(dǎo)入可能導(dǎo)致腫瘤的 cMyc；第三類小鼠是利用源自肝和胃細(xì)胞的 iPS育成的。 ? 結(jié)果：半數(shù)第一類小鼠發(fā)展出了腫瘤，大多數(shù)是甲狀腺瘤。 136只第二類小鼠中只有一只會(huì)產(chǎn)生腫瘤。不論是第一類還是第二類小鼠，不論 iPS源于纖維原細(xì)胞還是肝、胃細(xì)胞，只要重組的是成體細(xì)胞，小鼠的死亡率就會(huì)急劇增加。 ? 源于胃和肝的 iPS細(xì)胞的基因表達(dá)模式分析圖譜說(shuō)明，這些 iPS細(xì)胞并非徹底地?fù)碛卸嗄苄?，或許正是這種不完全的重組導(dǎo)致了小鼠死亡。 候選基因的變化 第 3章 細(xì)胞工程 130 進(jìn)展 2： 單個(gè)基因 就可誘導(dǎo)出 iPS細(xì)胞 ? 基因： Oct4 ? 載體：反轉(zhuǎn)錄病毒載體 ? 細(xì)胞來(lái)源：小鼠神經(jīng)干細(xì)胞 ? 獲得的 iPS細(xì)胞在體外可再培養(yǎng)成神經(jīng)干細(xì)胞，或者變成心肌細(xì)胞和生殖細(xì)胞 ?Jeong Beom Kim, et al. Oct4Induced Pluripotency in Adult Neural Stem Cells. Cell, Volume 136, Issue 3, 411419, 6 February 2022（馬克斯 普郎克分子生物醫(yī)藥研究所 ，德國(guó)波昂大學(xué) ） 第 3章 細(xì)胞工程 131 進(jìn)展 3：利用 4種重組蛋白誘導(dǎo) iPS細(xì)胞成功 ? 美國(guó) Scripps研究所， ProteomTech 公司，和德國(guó)馬克斯普朗克分子生物醫(yī)學(xué)研究所等 Cell Stem Cell, 23 April 2022 doi:Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using Rebinant Proteins ? 用四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的蛋白完成了由體細(xì)胞到誘導(dǎo)性干細(xì)胞的轉(zhuǎn)變過(guò)程。自始至終，細(xì)胞的遺傳信息沒(méi)有受到任何影響。 ? 已經(jīng)完成了體外和小鼠體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過(guò) 4個(gè)蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞具有完全的多能性。將這些 iPS細(xì)胞注入小鼠胚胎中能形成嵌合小鼠，經(jīng)過(guò)檢查，小鼠的體內(nèi)有兩種不同遺傳背景的細(xì)胞系，這證實(shí)誘導(dǎo)胚胎細(xì)胞具有多能性。 第 3章 細(xì)胞工程 132 蛋白誘導(dǎo)性干細(xì)胞的重大意義 ? 1）安全性：轉(zhuǎn)化過(guò)程沒(méi)有使用病毒，沒(méi)有使用基因，沒(méi)有任何改變細(xì)胞遺傳信息的風(fēng)險(xiǎn)； ? 2）普及性：蛋白誘導(dǎo)方法遠(yuǎn)比基因誘導(dǎo)方法簡(jiǎn)單易行。這樣一來(lái)， iPS技術(shù)不再被幾個(gè)資深實(shí)驗(yàn)室所壟斷。大部分實(shí)驗(yàn)室都可以重復(fù)蛋白方法而獲得 iPS。也就是說(shuō)，蛋白誘導(dǎo)方法大大降低了 iPS領(lǐng)域的 “ 門(mén)坎 ” 。 ? 3）可行性：由于該方法的簡(jiǎn)單易行，重復(fù)性強(qiáng)，它可以被擴(kuò)大化，產(chǎn)業(yè)化，進(jìn)而被商業(yè)化。 第 3章 細(xì)胞工程 133 進(jìn)展 4： 化學(xué)小分子 可替代基因誘導(dǎo) iPS細(xì)胞 ? 哈佛大學(xué)干細(xì)胞研究所 (HSCI) ? 利用一種小分子化學(xué)物質(zhì) RepSox代替了其中的 Sox2和 cMyc基因的功能，并且 RepSox是在該實(shí)驗(yàn)的不同時(shí)間以不同的形式發(fā)揮功能。由于 cMyc是腫瘤促進(jìn)因子 (tumor promoter)，利用 cMyc產(chǎn)生的 iPS細(xì)胞不能用于人類疾病治療，因此十分有必要尋找一種不使用 cMyc基因的產(chǎn)生 iPS細(xì)胞新方法。 Cell Stem Cell, 08 October 2022 doi:A SmallMolecule Inhibitor of Tgfβ Signaling Replaces Sox2 in Reprogramming by Inducing Nanog 第 3章 細(xì)胞工程 134 進(jìn)展 1： 成熟 B細(xì)胞 可重編程為 iPS細(xì)胞 ? 成纖維細(xì)胞：一種特殊類型的能分化成其他類型的皮膚細(xì)胞。由于無(wú)法分辨這些成纖維細(xì)胞是否已完全分化，先前實(shí)驗(yàn)中使用的細(xì)胞也許分化得比較少，因此更容易轉(zhuǎn)化為如同胚胎干細(xì)胞狀態(tài)的 iPS細(xì)胞。而成熟 B細(xì)胞的 DNA有特定的一部分在最終成熟階段會(huì)被剔除 。 ? 細(xì)胞來(lái)源：小鼠成熟和非成熟 B細(xì)胞 ? 病毒載體：反轉(zhuǎn)錄病毒 ? 基因： Oct Sox cMyc與 Klf4 ? 來(lái)自成熟與非成熟 B細(xì)胞的 iPS細(xì)胞能用來(lái)制造老鼠。這些來(lái)自重組成熟 B細(xì)胞的老鼠，同成熟 B細(xì)胞一樣缺失了相同部分的 DNA，這證明已成功地重組了已完全分化的細(xì)胞。 ?Jacob Hanna, et al. Direct Reprogramming of Terminally Differentiated Mature B Lymphocytes to Pluripotency. Cell, Vol 133, 250264, 18 April 2022(美國(guó)懷特黑德生物醫(yī)學(xué)研究所魯?shù)婪?詹尼士實(shí)驗(yàn)室 ) 細(xì)胞來(lái)源的拓展 第 3章 細(xì)胞工程 135 進(jìn)展 2：用 老年 ALS患者皮膚 制造 iPS細(xì)胞 ? 基因：同樣的四個(gè)基因 ? 細(xì)胞來(lái)源： 2位罹患肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥（ ALS）這種神經(jīng)退行性病變的老年病人的皮膚 ? 應(yīng)用：用這些 iPS 細(xì)胞培養(yǎng)出看來(lái)像是健康的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞。 ?John T. Dimos , et al. Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons. Science， DOI: （ 哈佛，凱文 艾根 ） 第 3章 細(xì)胞工程 136 進(jìn)展 3：從 成熟恒河猴成纖維細(xì)胞 中獲得 iPS細(xì)胞 ? 細(xì)胞來(lái)源：恒河猴成纖維細(xì)胞 ? 基因： OCT4, SOX2, KLF4 和 cMYC ? 載體：反轉(zhuǎn)錄病毒載體 ?Liu H, et al. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Adult Rhesus Monkey Fibroblasts. Cell Stem Cell. 2022 Dec 4。3(6):58790 （北大，鄧宏魁） 第 3章 細(xì)胞工程 137 進(jìn)展 1：僅僅兩個(gè)內(nèi)生因子（ Oct4 加上 Klf4或 cMyc），就足以從 成年小鼠神經(jīng)干細(xì)胞 生成 iPS細(xì)胞 ? 細(xì)胞來(lái)源：小鼠神經(jīng)干細(xì)胞 ? 基因： Oct4 加上 Klf4或 cMyc ? 載體：反轉(zhuǎn)錄病毒載體 ? 可能是因?yàn)檫@些神經(jīng)細(xì)胞比胚胎干細(xì)胞表達(dá)更高水平的內(nèi)生 Sox2 和 cMyc，這說(shuō)明具有適當(dāng)匹配的轉(zhuǎn)錄因子的體細(xì)胞是生成 iPS細(xì)胞的一個(gè)潛在有用的起始點(diǎn) ?Jeong Beom Kim, et al. Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors. Nature 454, 646650 (24 July 2022) | doi:(德國(guó)馬克斯 ?普朗克分子生物醫(yī)學(xué)研究院細(xì)胞與發(fā)育生物學(xué)系和德國(guó)亞琛工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)院 ) 誘導(dǎo)效率的提高 第 3章 細(xì)胞工程 138 進(jìn)展 2：兩種因子可提高 iPS轉(zhuǎn)化率 ? 細(xì)胞 來(lái)源 ： 人成纖維細(xì)胞 ? 兩種因子： p53 siRNA和 UTF1 ? 基因： OCT4,SOX2,KLF4和 cMYC（如果沒(méi)有 cMYC（具有致癌性基因），也同樣可以成功誘導(dǎo)人類的 iPS ） ?Yang Zhao, et al. Two Supporting Factors Greatly Improve the Efficiency of Human iPSC Generation. Cell Stem Cell, Volume 3, Issue 5, 6 November 2022 doi:（北大，鄧宏魁） 第 3章 細(xì)胞工程 139 進(jìn)展 3：綜述：高效誘導(dǎo) iPS的方法模型 ? Shinya Yamanaka集中介紹了 iPS的生成機(jī)制以及它的生成過(guò)程效率低、速度慢的原因。他最后提出了一個(gè)進(jìn)行直接重新編程的模型，按照該模型，所有或大多數(shù)細(xì)胞都有可能變成多能細(xì)胞。 Nature 4952 (2 July 2022) doi:Elite and stochastic models for induced pluripotent stem cell generation 第 3章 細(xì)胞工程 140 進(jìn)展 4：通過(guò)阻斷 p53基因路徑可以將 iPS轉(zhuǎn)化的成功率提高約百倍 ? 來(lái)自不同國(guó)家的 5個(gè)科研小組同時(shí)報(bào)告了相關(guān)進(jìn)展 ? 通過(guò)阻斷一個(gè)名為“ p53” 的基因的路徑，可以將皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)化為 iPS細(xì)胞的成功率提高至 10％左右，是原有轉(zhuǎn)化率的大約百倍，同時(shí)能更好地兼顧效率和安全。 Nature advance online publication 9 August 2022 | doi:Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53–p21 pathway 第 3章 細(xì)胞工程 141 進(jìn)展 5：低氧環(huán)境可提高培養(yǎng) iPS細(xì)胞效率 ?