【正文】 Nature 4952 (2 July 2022) doi:Elite and stochastic models for induced pluripotent stem cell generation 第 3章 細(xì)胞工程 140 進(jìn)展 4：通過阻斷 p53基因路徑可以將 iPS轉(zhuǎn)化的成功率提高約百倍 ? 來自不同國家的 5個科研小組同時報告了相關(guān)進(jìn)展 ? 通過阻斷一個名為“ p53” 的基因的路徑，可以將皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)化為 iPS細(xì)胞的成功率提高至 10％左右，是原有轉(zhuǎn)化率的大約百倍，同時能更好地兼顧效率和安全。3(6):58790 （北大，鄧宏魁） 第 3章 細(xì)胞工程 137 進(jìn)展 1：僅僅兩個內(nèi)生因子（ Oct4 加上 Klf4或 cMyc），就足以從 成年小鼠神經(jīng)干細(xì)胞 生成 iPS細(xì)胞 ? 細(xì)胞來源：小鼠神經(jīng)干細(xì)胞 ? 基因： Oct4 加上 Klf4或 cMyc ? 載體：反轉(zhuǎn)錄病毒載體 ? 可能是因為這些神經(jīng)細(xì)胞比胚胎干細(xì)胞表達(dá)更高水平的內(nèi)生 Sox2 和 cMyc，這說明具有適當(dāng)匹配的轉(zhuǎn)錄因子的體細(xì)胞是生成 iPS細(xì)胞的一個潛在有用的起始點 ?Jeong Beom Kim, et al. Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors. Nature 454, 646650 (24 July 2022) | doi:(德國馬克斯 ?普朗克分子生物醫(yī)學(xué)研究院細(xì)胞與發(fā)育生物學(xué)系和德國亞琛工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)院 ) 誘導(dǎo)效率的提高 第 3章 細(xì)胞工程 138 進(jìn)展 2：兩種因子可提高 iPS轉(zhuǎn)化率 ? 細(xì)胞 來源 ： 人成纖維細(xì)胞 ? 兩種因子： p53 siRNA和 UTF1 ? 基因： OCT4,SOX2,KLF4和 cMYC（如果沒有 cMYC（具有致癌性基因），也同樣可以成功誘導(dǎo)人類的 iPS ） ?Yang Zhao, et al. Two Supporting Factors Greatly Improve the Efficiency of Human iPSC Generation. Cell Stem Cell, Volume 3, Issue 5, 6 November 2022 doi:（北大，鄧宏魁） 第 3章 細(xì)胞工程 139 進(jìn)展 3：綜述：高效誘導(dǎo) iPS的方法模型 ? Shinya Yamanaka集中介紹了 iPS的生成機(jī)制以及它的生成過程效率低、速度慢的原因。 ?John T. Dimos , et al. Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons. Science， DOI: （ 哈佛，凱文 ?Jacob Hanna, et al. Direct Reprogramming of Terminally Differentiated Mature B Lymphocytes to Pluripotency. Cell, Vol 133, 250264, 18 April 2022(美國懷特黑德生物醫(yī)學(xué)研究所魯?shù)婪? ? 細(xì)胞來源：小鼠成熟和非成熟 B細(xì)胞 ? 病毒載體：反轉(zhuǎn)錄病毒 ? 基因： Oct Sox cMyc與 Klf4 ? 來自成熟與非成熟 B細(xì)胞的 iPS細(xì)胞能用來制造老鼠。由于無法分辨這些成纖維細(xì)胞是否已完全分化，先前實驗中使用的細(xì)胞也許分化得比較少，因此更容易轉(zhuǎn)化為如同胚胎干細(xì)胞狀態(tài)的 iPS細(xì)胞。由于 cMyc是腫瘤促進(jìn)因子 (tumor promoter)，利用 cMyc產(chǎn)生的 iPS細(xì)胞不能用于人類疾病治療，因此十分有必要尋找一種不使用 cMyc基因的產(chǎn)生 iPS細(xì)胞新方法。 ? 3）可行性：由于該方法的簡單易行，重復(fù)性強(qiáng)，它可以被擴(kuò)大化，產(chǎn)業(yè)化，進(jìn)而被商業(yè)化。大部分實驗室都可以重復(fù)蛋白方法而獲得 iPS。 第 3章 細(xì)胞工程 132 蛋白誘導(dǎo)性干細(xì)胞的重大意義 ? 1）安全性：轉(zhuǎn)化過程沒有使用病毒，沒有使用基因，沒有任何改變細(xì)胞遺傳信息的風(fēng)險； ? 2）普及性：蛋白誘導(dǎo)方法遠(yuǎn)比基因誘導(dǎo)方法簡單易行。 ? 已經(jīng)完成了體外和小鼠體內(nèi)的實驗，經(jīng)過 4個蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞具有完全的多能性。普郎克分子生物醫(yī)藥研究所 ，德國波昂大學(xué) ） 第 3章 細(xì)胞工程 131 進(jìn)展 3：利用 4種重組蛋白誘導(dǎo) iPS細(xì)胞成功 ? 美國 Scripps研究所， ProteomTech 公司，和德國馬克斯普朗克分子生物醫(yī)學(xué)研究所等 Cell Stem Cell, 23 April 2022 doi:Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using Rebinant Proteins ? 用四個轉(zhuǎn)錄因子的蛋白完成了由體細(xì)胞到誘導(dǎo)性干細(xì)胞的轉(zhuǎn)變過程。 ? 源于胃和肝的 iPS細(xì)胞的基因表達(dá)模式分析圖譜說明，這些 iPS細(xì)胞并非徹底地?fù)碛卸嗄苄?，或許正是這種不完全的重組導(dǎo)致了小鼠死亡。 136只第二類小鼠中只有一只會產(chǎn)生腫瘤。 第 3章 細(xì)胞工程 128 進(jìn)展 ? 候選基因的變化 ： 3個基因（小鼠）；或者 Oct4 加上 Klf4或 cMyc （成年小鼠神經(jīng)干細(xì)胞）；單個基因 —— Oct4(小鼠神經(jīng)干細(xì)胞 )； microRNA和三種基因（ miR2913p, miR294， miR295 和 Oct4, Sox2, Klf4） （鼠）、化學(xué)小分子 ,?? ? 細(xì)胞來源的拓展 ：成熟 B細(xì)胞（小鼠），老年 ALS患者皮膚（人類）；兒童 SMA患者皮膚（人類）， ?? ? 載體的改變 ：藥物 慢病毒系統(tǒng)（人類），腺病毒載體（小鼠），轉(zhuǎn)座子（人類），質(zhì)粒（小鼠；人），無病毒載體 ? 誘導(dǎo)效率的提高 ：兩種因子（人類）；阻斷 p53基因途徑；低氧環(huán)境（人類）； ? 安全性研究 第 3章 細(xì)胞工程 129 進(jìn)展 1：去除 cmyc基因之后，剩下的 3個基因仍然能誘導(dǎo)出 iPS細(xì)胞 ? （山中伸彌， 2022年 6月 14日，美國費(fèi)城，國際干細(xì)胞研究協(xié)會會議 ） ? 三種不同類型的嵌合小鼠，都是由小鼠 iPS細(xì)胞進(jìn)一步得來的：第一種類型的小鼠是在表皮細(xì)胞中導(dǎo)入四種轉(zhuǎn)錄子的基因副本（ Oct3/4， Sox2， cMyc和 Klf4）后得到的；第二類中沒有導(dǎo)入可能導(dǎo)致腫瘤的 cMyc；第三類小鼠是利用源自肝和胃細(xì)胞的 iPS育成的。早在 2022年 iPierian公司便對外宣稱，他們該獲得 iPS的相關(guān)專利。 ? 這是世界首個 iPS細(xì)胞相關(guān)專利，但鑒于人類 iPS細(xì)胞和實驗鼠 iPS細(xì)胞的培養(yǎng)方法差別顯著，在再生醫(yī)療領(lǐng)域備受期待的人類 iPS細(xì)胞專利能否獲得批準(zhǔn)，前景尚不明朗。 ? 獲批的專利內(nèi)容是“將４種基因植入普通體細(xì)胞，可使體細(xì)胞轉(zhuǎn)變成擁有分化為各種組織細(xì)胞能力的 iPS細(xì)胞”，專利有效期到 2026年 12月。日本規(guī)劃中的細(xì)胞庫將儲存 iPS細(xì)胞以及由其分化出來的各種臟器細(xì)胞。 受倫理譴責(zé) 。 山中伸彌 第 3章 細(xì)胞工程 123 iPS技術(shù)的價值所在 ? 突破一：實現(xiàn)了人類成熟體細(xì)胞的重編程為類似胚胎干細(xì)胞的多能干細(xì)胞 ? 突破二：開辟了人類干細(xì)胞來源的新途徑（人類之前的 ES細(xì)胞研究，都需要人類卵細(xì)胞作為來源。大約每 5000個細(xì)胞就能制造 1個 iPS細(xì)胞系。448(7151):3137. 2. Wernig M, Meissner A, Foreman R, Brambrink T, Ku M, Hochedlinger K,Bernstein BE, Jaenisch R. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent EScelllike . 2022 Jul 19。 第 3章 細(xì)胞工程 118 ? Yamanaka的觀點： cMyc 使全基因組廣泛去甲基化以松解染色質(zhì)，使 oct3/4和 sox2 接近到各自的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)位點發(fā)揮下游基因轉(zhuǎn)錄使細(xì)胞獲得多能性，而 klf4則扮演了兩個角色，一方面作為 oct4和 sox2的協(xié)同因子，另一方面發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用。第 13天可發(fā)現(xiàn)具備 iPS細(xì)胞發(fā)展而來的三個胚層組織的胚胎。結(jié)果，多數(shù)都表現(xiàn)出這樣多能性。細(xì)胞形成的畸胎瘤會有全部的三個胚層：外胚層、中胚層和內(nèi)胚層。 ? 24個基因， 反轉(zhuǎn)錄病毒載體 ，每個分別導(dǎo)入體細(xì)胞中培養(yǎng) → 無果 ? 全部導(dǎo)入 → 可使體細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)?iPS細(xì)胞 ? 24個基因， 1個 1個分別抽離 → 確定 10個 ? 10個基因， 1個 1個分別抽離 → 最后確定 4個 ?Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined . 2022 Aug 25。（ DNA序列未變化，但表觀遺傳上有變化，包括 DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)等） ? 以小鼠為對象重復(fù)青蛙的實驗獲得克隆小鼠 —— 說明： 哺乳動物的未受精的卵子中也存在可進(jìn)行重編程的因子 ? 后來發(fā)現(xiàn)：可對體細(xì)胞核進(jìn)行重編程的不僅僅有卵子， 胚胎干細(xì)胞也具有 同樣的功能（體細(xì)胞核移植到去核的胚胎干細(xì)胞中，也可使之胚胎發(fā)育成個體） ? 核移植技術(shù) ? 胚胎干細(xì)胞的體外培養(yǎng)（ 1980年：小鼠、 1998年：人類） ? —— 推斷：體細(xì)胞進(jìn)行核移植到去核的卵細(xì)胞或者胚胎干細(xì)胞中，均可使新細(xì)胞具有發(fā)育全能 /多能，或者說卵細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞中存在的特殊的因子，可使體細(xì)胞＆轉(zhuǎn)變?yōu)槲捶只癄顟B(tài)（如果將其應(yīng)用于人體，在再生醫(yī)學(xué)中將會有巨大的發(fā)展前景） —— 這就是干細(xì)胞研究中的一個熱點： iPS細(xì)胞領(lǐng)域。 第 3章 細(xì)胞工程 115 iPS出現(xiàn)的前提： ? 受精卵可發(fā)育成個體 —— 說明卵細(xì)胞具有分化全能 ? 蝌蚪的分化細(xì)胞（腸）的細(xì)胞核移植進(jìn)卵細(xì)胞后可指導(dǎo)其發(fā)育成個體（ 50年代） —— 說明： 未受精的卵子中的細(xì)胞質(zhì)存在一些因子，可以改變基因表達(dá)的模式，將已分化的細(xì)胞核轉(zhuǎn)變?yōu)槲捶只募?xì)胞核 。 由于涉及卵細(xì)胞的操作和對胚胎的破壞，會有一定的倫理、法律等的障礙 。 ? iPS細(xì)胞 (誘導(dǎo)式多能干細(xì)胞，induced pluripotent stem cell )：是指體細(xì)胞經(jīng)過基因重編程，回歸到胚胎干細(xì)胞的狀態(tài)，從而具有類似胚胎干細(xì)胞的分化能力 * 第 3章 細(xì)胞工程 114 background ? 再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域：器官移植（捐助的器官有限、異體移植會有免疫排斥反應(yīng)） ? 解決方法之一：直接采用多能干細(xì)胞進(jìn)行器官再生（可惜通常所用的 ES細(xì)胞來源于囊胚階段的胚或者是受精后 5~9周流產(chǎn)的胚胎，而且 外來的 ES細(xì)胞會有免疫排斥反應(yīng) ） ? 之二：治療性克?。ú捎煤艘浦布夹g(shù)將患者自身體細(xì)胞的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到捐助者的去核的卵細(xì)胞中，體外培養(yǎng)進(jìn)行胚胎發(fā)育后獲得人體早期胚胎，但目的不是將胚胎培育成人，而是從中提取胚胎干細(xì)胞，然后在合適的條件下，使其發(fā)育成為人體的任何一個器官，包括心、肺、腎、肝等。 ? iPS細(xì)胞：誘導(dǎo)式多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell ) iPS細(xì)胞核技術(shù)的定義、出現(xiàn)背景 2022年： iPS在小鼠細(xì)胞上實現(xiàn) 2022年： iPS在人類細(xì)胞上實現(xiàn) 進(jìn)展 iPS細(xì)胞的應(yīng)用 第 3章 細(xì)胞工程 113 iPS細(xì)胞核技術(shù)的定義、出現(xiàn)背景 ? iPS技術(shù)：誘導(dǎo)式多能干細(xì)胞技術(shù)。 第 3章 細(xì)胞工程 110 由胚胎干細(xì)胞到組織器官，仍然在研究當(dāng)中 第 3章 細(xì)胞工程 111 ? 從體外受精人胚中獲得的 ES細(xì)胞在適當(dāng)條件下能否發(fā)育成人？ ? 干細(xì)胞要是來自自愿終止妊娠的孕婦該如何辦？ ? 為獲得 ES細(xì)胞而殺死人胚是否道德？ ? 是不是良好的愿望為邪惡的手段提供了正當(dāng)理由？ ? 使用來自自發(fā)或事故流產(chǎn)胚胎的細(xì)胞是否恰當(dāng)？ ? 如果胚胎干細(xì)胞和胚胎生殖細(xì)胞可以作為細(xì)胞系而可買賣獲取，科學(xué)家使用它們符合道德規(guī)范嗎？ ? 什么類型的研究可被接受？ ? 允許科學(xué)家為研究發(fā)育過程或建立醫(yī)學(xué)移植組織而培養(yǎng)個體組織和器官嗎？ ? 由于目前已接受人體基因可以插入動物細(xì)胞中，將人胚胎干細(xì)胞嵌入家畜胚胎中創(chuàng)立嵌合體來獲得移植用人體器官是否道德？ ? 為了治療，改變來自有基因缺陷胚胎的 ES細(xì)胞的基因，并使其繼續(xù)發(fā)育成健康個體是否道德？ ? 如果人的替代組織極易獲取，會不會有更多的人將不負(fù)責(zé)任地生活，而從事高風(fēng)險的活動？ ? ?????????? ? 第 3章 細(xì)胞工程 112 iPS技術(shù) ? iPS技術(shù)：誘導(dǎo)式多能干細(xì)胞技術(shù)。