【正文】 由具有全能性細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞數(shù)在 32個左右，排列緊密，形似桑椹， 至此，細(xì)胞的分裂結(jié)束，下一個階段開始細(xì)胞分化。 第 3章 細(xì)胞工程 1．從早期胚胎獲得 ? 1998年，美國威斯康辛大學(xué) Thompson研究小組就是從囊胚期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團中獲得胚胎干細(xì)胞 102 體外受精卵 囊胚期 去除滋養(yǎng)層 發(fā)育 得 5株干細(xì)胞系 32代 (8個月 )保持未分化狀態(tài) 內(nèi)細(xì)胞團 培養(yǎng) 傳代 第 3章 細(xì)胞工程 2．從原始生殖細(xì)胞獲得 103 gearhart小組： ? 流產(chǎn)胎兒性腺嵴 原始生殖細(xì)胞 獲得 5個多能干細(xì)胞系 7個月不分化 思路：原始生殖細(xì)胞是未分化細(xì)胞 。 對稱分裂：干細(xì)胞 分裂 干細(xì)胞 干細(xì)胞 對稱分裂：干細(xì)胞 分裂 分化細(xì)胞 分化細(xì)胞 不對稱分裂：干細(xì)胞 干細(xì)胞 分化細(xì)胞 分裂 第 3章 細(xì)胞工程 100 ? ES細(xì)胞：由 早期胚胎（囊胚期 /胚泡期） 或原始性腺中分離出來的一類細(xì)胞（前者更常用），可冷凍保存，可進行遺傳改造。如骨髓多能造血干細(xì)胞，它可分化出至少十二種血細(xì)胞，但不能分化出造血系統(tǒng)以外的其它細(xì)胞。 全能干細(xì)胞：具有形成完整個體的分化潛能。分化潛能寬，具有分化為機體任何組織細(xì)胞的能力，如囊胚期 (受精后 5~7天 )內(nèi)細(xì)胞團的細(xì)胞、原始生殖細(xì)胞 成體干細(xì)胞 （ adult stem cell， ASC）： 具有自我更新能力，但分化潛能窄，只能分化為相應(yīng)(或相鄰 )組織器官組成的細(xì)胞， 如： 骨髓、大腦、神經(jīng)、皮膚、胰腺、角膜、脂肪、心臟、肝臟等組織源干細(xì)胞 * 第 3章 細(xì)胞工程 97 分化潛能 單能 /專能 /偏能 /定向干細(xì)胞：只能向一種類型或密切相關(guān)的兩種類型的細(xì)胞分化。 or ? 具有多項分化潛能和自我復(fù)制、更新能力的 原始未分化細(xì)胞 ，是形成各種組織器官的祖宗細(xì)胞。而干細(xì)胞可以分化成人體的各種組織和器官，在器官移植和探尋像帕金森氏癥、糖尿病等疾病的病因方面都有著廣闊的應(yīng)用前景。 進行人獸混合胚胎研究的目的主要是用于治療性克隆研究。 為此科學(xué)家們就考慮把人的體細(xì)胞移植到 去核的動物卵母細(xì)胞 中，讓其發(fā)育成為一個混合的異種克隆胚胎進行胚胎干細(xì)胞研究，進行“胞質(zhì)雜交”，獲得完全具有人類性狀的干細(xì)胞胚胎。 世界一些國家對克隆人研究的態(tài)度： 第 3章 細(xì)胞工程 91 ? 從需要救治的病人身上提取體細(xì)胞 ? 將該細(xì)胞的遺傳物質(zhì)置入一個去除了細(xì)胞核的卵細(xì)胞 ? 該卵細(xì)胞開始自行分裂，直至形成一個早期胚胎 ? 從這早期胚胎中提取胚胎干細(xì)胞 ? 胚胎干細(xì)胞經(jīng)過相應(yīng)的技術(shù)處理，便可發(fā)展成遺傳特征與病人完全吻合的細(xì)胞、組織或器官 ? 以前器官移植治療方法中經(jīng)常出現(xiàn)的排異反應(yīng)問題因此得到了徹底解決 ? 血細(xì)胞、腦細(xì)胞、骨骼和內(nèi)臟等都將可以更換 ? 癌癥、白血病、帕金森氏癥、心臟病等頑疾也有望得到有效的治療與治愈 ? 由于從早期人類胚胎中提取的干細(xì)胞擁有形成所有的人體細(xì)胞類型的能力，因而它也就有可能成為 21世紀(jì)最重要、最理想的人體器官替代物的原料。 意大利： 2022年 3月，意大利眾議院批準(zhǔn)了政府于 1998年簽署加入歐洲禁止克隆人協(xié)議。 德國： 1991年德國實行 《 胚胎保護法 》 ，嚴(yán)格禁止人類胚胎干細(xì)胞研究以及克隆胚胎干細(xì)胞。 英國： 1990年通過的 《 人類授精和胚胎學(xué)法案 》 ，認(rèn)為克隆人類胚胎的研究是非法的。 美國： 2022年 7月 31日，美國國會眾議院通過了一項全面禁止克隆人的法案。這是國際上第一個禁止克隆人的文件?？寺∨！⒀?、豬都存在發(fā)育不良、免疫系統(tǒng) 缺陷和心肺功能不健全的問題?？寺⊙蚝涂寺∨６加畜w形過度龐大的問題。 這個孩子就是人類的試驗品，這位代孕的母體起到的也僅僅是一個生育機或孵化器的作用。 第 3章 細(xì)胞工程 87 社會、倫理問題 ? 他（她）是正常人嗎？該如何看待他（她）？ ? 他（她）的父母是誰？ ? 誰生育了他（她）？誰愛他（她）？ ? 有可能產(chǎn)生真正相同的克隆的孿生子嗎？ Who am i？ 不管克隆技術(shù)怎樣發(fā)展，克隆人怎樣產(chǎn)生，都是人，與被克隆人實質(zhì)上是存在著年齡差的同胞胎。 “治療性克隆”： 第 3章 細(xì)胞工程 86 克隆人類？ ? 將普通的體細(xì)胞（男性或女性來源均可）和一枚女性卵子結(jié)合起來（儲存于女性卵子中的遺傳信息將事先被消除）。 “生殖性克隆”： * 指出于生殖的目的使用克隆技術(shù)在實驗室制造人類胚胎，然后將胚胎置入人類子宮發(fā)育成胎兒和嬰兒的過程。 ? 可以用患者本人細(xì)胞培育出新組織（器官移植）。 第 3章 細(xì)胞工程 84 應(yīng)用價值及意義 ? 檢驗動物細(xì)胞全能性 ? 加速動物繁殖、優(yōu)良育種、保護珍貴動物。 2022年，體細(xì)胞克隆大鼠誕生。 2022年，體細(xì)胞克隆貓誕生。 2022年，體細(xì)胞克隆狗誕生。 2022年，英國從成年動物體細(xì)胞克隆出 5 頭豬。 2022年，楊向中博士領(lǐng)導(dǎo)的實驗室在美國從體外培養(yǎng) 613 代的細(xì)胞克隆出 6頭公牛。 1998年，新西蘭科學(xué)家從一頭珍稀?？寺『蟠? 第 3章 細(xì)胞工程 83 1998年，美國夏威夷大學(xué) 等率先在雌性小鼠上進行了成年體細(xì)胞克隆 。 ? 1999年，法國全國農(nóng)業(yè)研究所的克隆牛犢出生一月后死亡。 4存在問題 Dolly的命運： ? 2022年 2月 14日，多莉因肺部感染無法治愈而死亡， “ 享年 ” 不足 7歲。 第 3章 細(xì)胞工程 82 ? 成功率始終很低 ， 具有極大的偶然性和隨機性 。 3哺乳動物進行克隆的基本過程 * 第 3章 細(xì)胞工程 80 具體操作 ?從一只６歲芬蘭多塞特 白面母綿羊（Ａ） 的乳腺中取出乳腺細(xì)胞，將其放入低濃度的營養(yǎng)培養(yǎng)液中饑餓，細(xì)胞逐漸停止分裂進入休眠狀態(tài)而使全部基因具有活性，此細(xì)胞稱之為 “ 核供體細(xì)胞 ” ； ?注射促性腺激素 GN促使母羊（蘇格蘭 黑面母綿羊）（Ｂ） 排卵， 28～ 33h后從卵巢中取出未受精的卵細(xì)胞快速去除細(xì)胞核，放入 10%FCS（小牛血清）、1%FCS和 %FCS連續(xù) 5天，饑餓使進入 G0期做受體細(xì)胞； 第 3章 細(xì)胞工程 81 ?利用電脈沖融合方法，使供體細(xì)胞和受體細(xì)胞融合，最后形成 “ 融合細(xì)胞 ” 。 第 3章 細(xì)胞工程 79 克隆“多莉”示意圖 ? 一只懷孕三個月的芬蘭多塞特母綿羊，提供了全套遺傳信息，即提供了細(xì)胞核（稱之為供體）； ? 兩只是蘇格蘭黑面母綿羊。在此之前，人們從未能從哺乳動物的已分化的體細(xì)胞再培育出基因相同的個體。 第 3章 細(xì)胞工程 78 里程碑式的突破 ? 英國羅斯林（ Roslin）研究所維爾穆特 (Wilmut)博士 1997年 2月 27日在 《 Nature》 宣布用乳腺細(xì)胞的細(xì)胞核成功克隆出一只綿羊 “ 多莉 (Dolly) ” 。這是第一例得到證實的克隆哺乳動物。 ? 1984年，英國劍橋大學(xué)生物學(xué)家斯蒂恩 ? 1962年，美國的發(fā)育生物學(xué)家約翰 斯皮曼建議用 成年的細(xì)胞核 植入卵子的辦法進行哺乳動物克隆。 克隆 1幾個基本概念 第 3章 細(xì)胞工程 76 （動物細(xì)胞的）核移植 將供體細(xì)胞核移入去核的卵母細(xì)胞中 ,使后者不經(jīng)精子穿透等有性過程即可被激活、分裂并發(fā)育 ,使得核供體的基因得到完全復(fù)制。 第 3章 細(xì)胞工程 71 融合后的細(xì)胞生長狀況 剛?cè)?合完成 一個癌細(xì)胞與兩個脾臟細(xì)胞 經(jīng)數(shù)次分裂后 穩(wěn)定的細(xì)胞群落 Juang RH (2022) 第 3章 細(xì)胞工程 72 PEG 脾臟細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞 細(xì)胞融合 HAT初步篩選雜合細(xì)胞 ELISA 篩選抗體 m m 1 1 1 3 3 3 3 2 m 1 4 3 m 1 2 3 4 2 m m m m 3 4 1 2 m m 4 3 1 m m m m m m 2 2 2 4 4 4 4 第 3章 細(xì)胞工程 73 單克隆抗體的應(yīng)用 ? 醫(yī)學(xué)檢驗試劑：主要用于特異性、敏感性要求高的的實驗技術(shù)中，如傳染病的快速診斷；尋找腫瘤特異性抗原及檢測腫瘤相關(guān)抗原；免疫細(xì)胞抗原檢測，等等（主要是利用抗原抗體的特異性反應(yīng)檢測特異性抗原）。 BALB/c mouse 單克隆抗體制備過程 第 3章 細(xì)胞工程 66 小 白 鼠 免 疫 流 程 抗原混合弗氏完全佐劑進行初次免疫 至少三次相同劑量的加強免疫 效價測定 最后一次加強免疫 取出脾臟，制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞融合 B A LB / cBALB/c 0 2 4 6 8 10 12 14 wk 試采血 加 佐劑制成乳劑 佐劑 :能使抗原緩慢釋放，以便延長抗原與免疫系統(tǒng)接觸的時間；產(chǎn)生高親和力的免疫應(yīng)答 第 3章 細(xì)胞工程 67 ②免疫后取出脾臟 第 3章 細(xì)胞工程 68 脾臟為 B細(xì)胞集中地 取出 脾臟內(nèi)細(xì)胞（ 無菌條件下操作。 雜合細(xì)胞 單克隆抗 體 * 第 3章 細(xì)胞工程 62 1975年，英國劍橋大學(xué)分子生物學(xué)研究室將已適應(yīng)于體外培養(yǎng)的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與用綿羊紅細(xì)胞免疫過的小鼠脾細(xì)胞（ B淋巴細(xì)胞）進行融合，發(fā)現(xiàn)融合形成的雜交瘤細(xì)胞具有雙親細(xì)胞的特征：即像骨髓瘤細(xì)胞一樣在體外培養(yǎng)中能夠無限地快速增殖，又能持續(xù)地分泌特異性抗體。 用單個 B淋巴細(xì)胞進行無性增殖（擴增），也就是通過克隆，形成細(xì)胞群，這樣的細(xì)胞群就有可能產(chǎn)生出化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強的抗體 ——單克隆抗體 第 3章 細(xì)胞工程 60 傳統(tǒng) 抗血清 抗 原 免 疫 所有 抗體 混合 1 2 3 4 B A LB / c1 2 3 4 1 2 3 4 脾 臟 淋巴 結(jié) B細(xì)胞 一種抗原通常具有多個不同的抗原決定簇，因此能刺激多個 B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的單克隆抗體，因此血清中的抗體是針對不同抗原決定族的單克隆抗體混合物，稱為 多克隆抗體 。 ?要想獲得大量的單一抗體，必須用單個 B細(xì)胞進行無性繁殖，即克隆。 ?用這種方法獲得的抗體，只能是混合抗體 ,產(chǎn)量低，特異性差，純度低，反應(yīng)不夠靈敏。 ?以該種方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液或多或少都有冰晶的形成。 ? 在復(fù)蘇時，一般以很快的速度升溫， 12分鐘內(nèi)即恢復(fù)到常溫。 第 3章 細(xì)胞工程 53 動物細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇 ? 冷凍保存 ：將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加 冷凍保護劑 的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度（一般是低于 70℃ 的超低溫條件），并在此溫度下對其長期保存的過程。） 環(huán)境要求高：溫度和 pH + , 氣體環(huán)境： O2和 CO2（ 95%空氣和 5% CO2 ） 保證細(xì)胞順利的生長增殖 不同血清對細(xì)胞作用不同。如中國地鼠卵巢細(xì)胞，小鼠 L929細(xì)胞。 這類細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點是胞體始終為球形 。 ? 一些在體內(nèi)原本就以懸浮狀態(tài)生長的細(xì)胞 ， 當(dāng)接種于體外環(huán)境中也可以以懸浮狀態(tài)生長 。 ? 正常二倍體細(xì)胞的生長壽命是有限的，而異倍體細(xì)胞無接觸抑制現(xiàn)象，其壽命是無限的，如腫瘤細(xì)胞。 要求： 培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿的內(nèi)表面光滑、無毒、易于貼附。 第 3章 細(xì)胞工程 47 貼壁依賴性細(xì)胞 ?動物細(xì)胞培養(yǎng)中，大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞 需有給予貼附的支持物表面，細(xì)胞依靠自身分泌的或培養(yǎng)基中提供的貼壁因子才能在該表面上生長、增殖。 第 3章 細(xì)胞工程 45 基本過程： 動物胚胎或幼齡動物的組織、器官 細(xì)胞懸浮液 胰蛋白酶 10代細(xì)胞 原代培養(yǎng)的細(xì)胞 50代細(xì)胞 細(xì)胞株 無限傳代 細(xì)胞系 單個細(xì)胞 加培養(yǎng)液 遺傳物質(zhì) 未改變 動物組織細(xì)胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。動物細(xì)胞培養(yǎng)適宜的 pH為 － ，此環(huán)境下胃蛋白酶（最適）沒有活性，而胰蛋白酶 ()的活性較高。 細(xì)胞系： 體外培養(yǎng)的動物細(xì)胞傳到 4050代后有部分細(xì)胞遺傳物質(zhì)發(fā)生了變化，帶有癌變的特點，可能在培養(yǎng)條件下 無限制的傳代 下去，這種傳代細(xì)胞稱為細(xì)胞系。培養(yǎng)的細(xì)胞形成單層匯合以后，由于密度過大生存空間不足而引起營養(yǎng)枯竭，將培養(yǎng)的細(xì)胞分散，從容