【正文】 n公司支付了 15萬美元 ,在四次嘗試失敗后，最終在今年 8月 8日成功克隆了她的賽馬 ——奪得過十項世界冠軍的“斯卡普”，產(chǎn)下小馬駒“克萊頓” 細胞工程 體細胞克隆 東北農(nóng)業(yè)大學劉忠華教授帶領(lǐng)的課題組，把水母綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)移到豬胎兒成纖維細胞的基因組中，再把轉(zhuǎn)基因體細胞的細胞核移植到成熟的去核豬卵母細胞中構(gòu)建成轉(zhuǎn)基因胚胎。 細胞核的制備 ? 顯微操作法 ? 細胞松弛素 B處理法 細胞培養(yǎng) 獲得 核質(zhì)體 和 胞質(zhì)體 離心 細胞松弛素 B處理 細胞核移植 細胞工程 細胞核移植與動物克隆 體細胞克隆 細胞工程 細胞核移植與動物克隆 維爾穆特等用羊乳腺細胞克隆了多莉 （ 1996） 取 434個綿羊乳腺細胞的細胞核與同等數(shù)量的去核卵電激融合 277個融合細胞（ %） 移入母羊輸卵管發(fā)育，成功 247個（ %） 發(fā)育到桑椹胚 29個（ %） 分別植入 13只母羊子宮 僅生一只“多莉”（ %） 細胞工程 體細胞克隆 “多莉（ Dolly） ” 的身世 ，將其放入低濃度營養(yǎng)液中，細胞逐漸停止了分裂，此細胞稱之為供體細胞； 2. 從一頭蘇格蘭黑面母綿羊的卵巢中取出未受精的卵細胞，并立即將其細胞核除去，留下一個無核的卵細胞，此細胞稱之為受體細胞； 3. 利用電脈沖的方法，使供體細胞和受體細胞發(fā)生融合，最后形成了融合細胞，由于電脈沖還可以產(chǎn)生類似于自然受精過程中的一系列反應，使融合細胞也能像受精卵一樣進行細胞分裂、分化，從而形成胚胎細胞，進行早期胚胎發(fā)育； 4. 將早期胚胎轉(zhuǎn)移到蘇格蘭黑面母綿羊的子宮內(nèi)，胚胎細胞進一步分化和發(fā)育，最后形成一只小綿羊。 o 離心法 PEG1000 30% ~40%，離心 5~8min。g/mL) 真菌 制霉菌素（ 100U/mL) 支原體 卡那霉素（ 100 181。 細胞工程 培養(yǎng)物的長期保存 目前最常用的是液氮保存法： ? 將成熟培養(yǎng)物 (細胞 )與 5%～ 10%的甘油或二甲亞砜混勻，封裝于若干個安瓿瓶中； ? 緩慢降溫 (1～ 3℃ /min)至 30℃ ； ? 繼續(xù)降溫 (15～ 30℃ /min)至 150℃ ； ? 轉(zhuǎn)移至液氮凍存，可無限期保存。EDTA 培養(yǎng)物的傳代 無血清培養(yǎng) 細胞和組織的體外培養(yǎng)一般都需添加一定量的血清，不僅價格昂貴、容易混進污染物 (包括病毒和病菌 )，而且其成分不能完全確定，不同批次的血清之間難以保證實驗結(jié)果的可重復性。 細胞工程 動物細胞工程 制備動物細胞 無菌取出目的組織 無菌組織 小組織塊 細胞 移放培養(yǎng)瓶 抗生素漂洗 離心洗滌 細胞工程 動物細胞工程 培養(yǎng)液漂洗 切割 解離液 細胞培養(yǎng)法 細胞工程 ? 微導管法 以醋酸纖維素或硝酸纖維素構(gòu)成空心纖維管，搭成多層培養(yǎng)床。 細胞工程 植物脫病毒技術(shù) 動物細胞工程 細胞工程 3 細胞工程 ? 動物細胞與組織培養(yǎng) ? 動物細胞融合 ? 動物細胞核移植與胚胎克隆 ? 淋巴細胞雜交瘤與單克隆抗體 ? 染色體轉(zhuǎn)移與基因轉(zhuǎn)移 ?細胞系 （ cell line) 原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后的細胞培養(yǎng)物，包括有限細胞系和連續(xù)細胞系。 ? 脫毒唐菖蒲 長勢旺盛，花色艷，品質(zhì)提高 1～ 2個等級。 ?花瓣培養(yǎng) ?花藥培養(yǎng) 細胞工程 植物脫毒途徑 植物脫毒處理 植物莖 除菌 超凈臺 無菌 植物莖 超凈臺 無菌切割 無菌莖尖 無菌培養(yǎng) 無菌苗 脫毒苗 檢測 細胞工程 植物脫毒途徑 種子脫毒 ?誘導植物進入種子繁殖階段，形成種子、未成熟種子或種子胚 ?檢驗其是否帶毒 ?取無病毒種子胚進行組培快速繁殖 浙江大學專利（ 2022） 細胞工程 植物脫毒途徑 ? 外形觀察法 ? 電鏡法 ? 免疫血清法 離心去渣 植物組織勻漿 上清液 純化病毒 待檢植物勻漿上清液 動物免疫 抗血清（抗體） 免疫檢測 植物脫毒檢測 細胞工程 植物脫病毒技術(shù) 植物脫病毒進展 ? 脫毒馬鈴薯（青海） 染病毒的普通馬鈴薯畝產(chǎn)約 1噸，脫病毒的馬鈴薯畝產(chǎn)達 4噸。 細胞工程 固定化細胞培養(yǎng)系統(tǒng) 植物原生質(zhì)體制備與融合 細胞工程 植物細胞工程 植物原生質(zhì)體 幾個名詞： ? 原生質(zhì)體（ protoplast):去除全部細胞壁的細胞 ? 亞原生質(zhì)體（ subprotoplast):只含有部分原生質(zhì)的原生質(zhì)體（有核或無核） ? 微原生質(zhì)體（ miniprotoplast):經(jīng)細胞松弛素 B處理得到的僅含少量胞質(zhì)及核或染色體的小原生質(zhì)體 ? 原生質(zhì)球（球狀體， spheroplast):殘存少量細胞壁的原生質(zhì)體 細胞工程 植物原生質(zhì)體制備與融合 ?外植體除菌 ?外植體酶解 （纖維素酶為主） 除菌后葉片 撕去下表皮 切塊放入反應 不時輕搖 反應液轉(zhuǎn)綠 細胞工程 植物原生質(zhì)體制備與融合 25～ 30℃ 2~4h 原生質(zhì)體的制備 原生質(zhì)體分離 ? 過濾法 ? 離心法（低速） ? 漂浮法（不同比重） 細胞工程 原生質(zhì)體的制備 雙親本 原生質(zhì)體 滴加聚乙二醇 25℃ 保溫15～ 45min 滴加高鈣高 pH溶液 培養(yǎng)液 洗 滌 篩選 鑒定 目的植株 細胞工程 植物原生質(zhì)體制備與融合 原生質(zhì)體的融合 野生馬鈴薯和栽培馬鈴薯細胞融合 融合前 融合 2 min 融合 3 min 融合 10 min 細胞工程 原生質(zhì)體的融合 設想中的 “ 番茄 馬鈴薯 ” 細胞工程 原生質(zhì)體的融合 單倍體植物的誘發(fā)與利用 細胞工程 植物細胞工程 ?單倍體植物的特點 ? 一套染色體 ? 株矮，葉、花、果小，生活力弱 ? 高度不育 ? 加倍后可得到純合隱性基因表達植株 單倍體植株的培育 ?選取成熟度適中的花藥 ?離體成熟花粉培養(yǎng) ?未授粉子房或胚珠的培養(yǎng) ?雜交法獲單倍體植株 ? 選擇適當?shù)呐囵B(yǎng)基（添加激素、脯氨酸等） ? 適當密植 細胞工程 單倍體植物的誘發(fā)與利用 單倍體植物的加倍 ?秋水仙素（ %～ %）處理 24～ 48h ?全苗或根或芽 ?處理后洗凈，弱光保濕培養(yǎng) 細胞工程 單倍體植物的誘發(fā)與利用 人工種子的研制 細胞工程 植物細胞工程 人工種子：含有植物胚狀體或芽、營養(yǎng)成分、激素以及其他成分的人工膠囊。 缺點：占地面積大； 分化區(qū)比例較小； 02供應受限。 封閉式植物細胞培養(yǎng)系統(tǒng) 細胞工程 植物細胞培養(yǎng)和次生代謝物的生產(chǎn) ?次生代謝物的積累和細胞分化具有正相關(guān)性 ? 細胞固定化有利于組織化的形成； ? 細胞固定化有利于在細胞團內(nèi)外形成化學物質(zhì)和物理因素的梯度，這是高產(chǎn)次生代謝物的關(guān)鍵； ? 細胞固定化有利于對外環(huán)境參數(shù)進行調(diào)控； ? 細胞固定化有利于回收次生代謝物。 生根長芽階段 細胞工程 植物組織培養(yǎng) 細胞工程 生根長芽階段 ? 保濕是關(guān)鍵 ? 避免強光直射 ? 溫度適宜 移栽成活階段