【正文】 PCR 5’隨機(jī)引物 放射性標(biāo)記 dNTPs NMTTTTTTTTT TT D cDNA ● 優(yōu)點(diǎn)： ① 可以同時(shí)比較多個(gè)樣品間基因表達(dá)的差異； ②可以同時(shí)檢測(cè)到 “ 上游 ” 及 “ 下游 ” 基因； ③檢測(cè)靈敏度高 ,所需樣品少 ,經(jīng)過(guò) PCR擴(kuò)增一些 低豐度的 mRNA也可以被檢測(cè)出來(lái)； ④結(jié)合使用了 PCR和序列膠電泳分析兩項(xiàng)技術(shù) ,使 本法具有高效性。此法可對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行較詳細(xì)的分析， 如 RNA轉(zhuǎn)錄的大小及豐度等。 ● 斑點(diǎn)雜交與印跡雜交的區(qū)別： 斑點(diǎn)雜交 只需要將 RNA樣品點(diǎn)在固相膜上直接與 探針雜交。 二 .體細(xì)胞胚發(fā)生中基因表達(dá)常用鑒定方法 (1) Northern雜交： 通過(guò)細(xì)胞總 RNA或 Ploy(A) mRNA與探針的雜交 來(lái)分析基因轉(zhuǎn)錄水平的方法，稱(chēng) Northern 雜交。 ● 植物細(xì)胞中 mRNA合成的知識(shí)主要來(lái)自于對(duì)幾種能產(chǎn)生高豐 度 mRNA的基因的研究。 擬南芥根離體培養(yǎng)過(guò)程中和莖（芽）形成相關(guān)基因的表達(dá)順序 自體調(diào)節(jié) /反饋調(diào)節(jié) 原套 原體 cz PZ RZ STM CUC2 出生側(cè)枝 ?擬南芥胚胎發(fā)育過(guò)程中典型基因的表達(dá)模式 GA STM (KNOX) CK ARR WUS High CK/Auxin Ratio Low GA AUXIN STM (KNOX) CK CUC Low CK/Auxin Ratio High GA ?胚胎發(fā)育過(guò)程中典型基因的表達(dá)模式 167。 以擬南芥為例 ,擬南芥中有 4個(gè) KNOX基因 : STM,BP,KNAT2和 KNAT6。肋區(qū)促成莖的伸長(zhǎng)。 Ⅱ 亞家族： 在所有植物組織中均表達(dá)，由于表達(dá)廣泛且缺乏 響應(yīng)的突變體，目前對(duì)其研究較少。 調(diào)節(jié)植物體內(nèi)激素 的分布和時(shí)間 腋芽和莖尖分生組織發(fā)育 的時(shí)間和腋芽形成數(shù)目 （促進(jìn)或抑制）腋芽分生組織及其后的發(fā)生發(fā)育過(guò)程的基因 ● 與生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素或獨(dú)角金內(nèi)酯信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的因子 : PIN、 CRE AHKS、 MAX1等； ● 與細(xì)胞分裂相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶CDKS（ cyclin dependentkinase）； ● 與莖尖分生組織發(fā)育相關(guān)基因： KNOX、 WUS、 MOC LS、CLV CLV3等； 腋芽分生組織及 其后的發(fā)生發(fā)育過(guò)程 三 .KNOX基因與莖尖組織發(fā)育 KNOX（ KNOTTEDlike homeobox genes） 家族是植物中 的 4個(gè)同源異型盒基因家族（ KNOX、 WOX、 BELL、 HDZIP） 之一，幾乎存在于所有的單子葉和雙子葉植物中。 源于莖尖分生組織中的某些新細(xì)胞，即 “ de novol cells”理論（擬南芥）。 ?現(xiàn)有的研究主要集中在兩個(gè)方面 :一是從解剖學(xué)角度說(shuō)明其形態(tài)發(fā)生過(guò)程；另一個(gè)是尋找參與調(diào)控器官原基發(fā)生和表達(dá)的基因與蛋白。 ● 發(fā)育 （ development）： 發(fā)生特異分裂的細(xì)胞進(jìn)入不定芽再生的發(fā)育路徑。 一 .離體培養(yǎng)過(guò)程中的發(fā)育事件 ● 感受 （ petence）： 某些細(xì)胞對(duì)激素的誘導(dǎo)產(chǎn)生反應(yīng)。 35 離體培養(yǎng)器官發(fā)生的調(diào)控機(jī)制 在合適的培養(yǎng)條件下，離體的組織或細(xì)胞可以脫分化、再分化形成任何我們所需的芽、根、葉、花，并逐步發(fā)育成完整的植株。 愈傷組織繼代培養(yǎng)的次數(shù)與細(xì)胞染色體變異的頻率呈正相 關(guān)，即細(xì)胞倍性混亂程度增大，異形核細(xì)胞比 例增加。 ◆ 無(wú)性系的變異是極其廣泛的： 五種不同愈傷組織的染色體變異 愈傷組織來(lái)源 觀察細(xì)胞數(shù) 變異細(xì)胞數(shù) 變異頻率 (%) 變異范圍 煙草葉片 (n=24) 127 98 8～ 96 枸杞葉片 (2n=24) 126 81 6～ 48 伊貝母鱗莖 (2n=24) 64 39 13～ 60 白蘭瓜子葉 (2n=24) 217 166 8～ 162 山黧豆胚根 (2n=14) 211 155 6～ 140 ： ● 數(shù)量變異 ： 如核融合、核內(nèi)有絲分裂、核內(nèi)染色體復(fù)制等產(chǎn)生整倍多倍體；一些不正常的有絲分裂則導(dǎo)致產(chǎn)生非整倍體，如多極分裂、落后染色體、染色體后期橋等； ● 結(jié)構(gòu)變異： 分裂過(guò)程中染色體的重復(fù)、缺失、易位和倒位等。多基因控制的數(shù)量性狀變異 ,如株高、抽穗期變異等。 ◆ 人工種子的制作 ,優(yōu)良種質(zhì)的保存和無(wú)性系繁殖等 ,正是基于體細(xì)胞胚的基因型與原親本的相同性。 三 .遺傳穩(wěn)定性與變異性 ： 一般認(rèn)為 ,通過(guò)體細(xì)胞胚發(fā)生途徑形成再生植株是 相對(duì)穩(wěn)定的。但生理隔離也只是相對(duì)的 ,并不意味著它們與周?chē)M織在生理上完全隔離開(kāi) ,在體細(xì)胞胚發(fā)生與發(fā)育過(guò)程中 ,必須從周?chē)?xì)胞中取得營(yíng)養(yǎng)、能量和激素等 ,不僅有相互依存關(guān)系 ,而且有相互競(jìng)爭(zhēng)的關(guān)系。 因而如何改善條件 ,減少細(xì)胞間相互競(jìng)爭(zhēng)作用是提 高體細(xì)胞胚發(fā)生頻率的重要途徑。 胚性細(xì)胞形成后，并不是所有的都能進(jìn)一步發(fā)育 成體細(xì)胞胚，這里除了培養(yǎng)誘導(dǎo)條件外，細(xì)胞間的 相互作用與競(jìng)爭(zhēng)是重要的因素。 ◆ 多種植物中都觀察到 ,早期的胚性細(xì)胞與周?chē)?xì)胞還存在胞間連絲 ,但隨著胚性細(xì)胞的發(fā)育 ,細(xì)胞壁加厚 ,胞間連絲消失或被堵塞。 ◆ 在小孢子發(fā)生時(shí) ,小孢子母細(xì)胞在減數(shù)分裂前期也與絨氈層的細(xì)胞間沒(méi)有聯(lián)系。 (physiological isolation)： 即胚性細(xì)胞與周?chē)?xì)胞或組織形成明顯界限的現(xiàn)象。 ● 小麥的胚性細(xì)胞的細(xì)胞核和質(zhì)向一端偏移 , 細(xì)胞器、核糖體和質(zhì)體等都有區(qū)域性集中分布現(xiàn)象 ,并和細(xì)胞核偏移的方向一致。 表達(dá)階段 生理生化變化的范圍與程度，決定外植體形態(tài)發(fā)生的質(zhì)量。 預(yù)定階段 培養(yǎng)基成分，尤其是激素的種類(lèi)與水平，決定了外植體基因活動(dòng)的水平。 3. 體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為胚性細(xì)胞的漸變理論 即一個(gè)細(xì)胞系的發(fā)生與形成是一個(gè)特定基因組中 基因活化的結(jié)果： ● 一是預(yù)定階段，即細(xì)胞在脫分化時(shí)基因所處的 特殊狀態(tài)（預(yù)定性）； ● 二是表達(dá)階段，在適合的 誘導(dǎo)條件下 ,預(yù)定的細(xì)胞發(fā)生一系列的生理生化和形 態(tài)上的變化 ,表現(xiàn)出分化的特性。 用同位素脈沖標(biāo)記實(shí)驗(yàn)可以證明，一些形成的胚性 細(xì)胞團(tuán)也是由一個(gè)單細(xì)胞連續(xù)分裂而形成的。 ● 在石防風(fēng)懸浮培養(yǎng)的體細(xì)胞中也觀察到 無(wú)絲分裂 ，其中多為縊縮分裂，形成兩個(gè)細(xì)胞核； ● 3H胸苷 (3HdT)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)表明 ,開(kāi)始是愈傷組織外層少數(shù)細(xì)胞被標(biāo)記。 34 體細(xì)胞胚的起源與遺傳穩(wěn)定性 一 . 體細(xì)胞胚的起源 1. 絕大多數(shù)體細(xì)胞胚是起源于單細(xì)胞，證據(jù)： ● 從多種植物中都觀察到單個(gè)的胚性細(xì)胞、均等分裂的和不均等分裂的二細(xì)胞原胚； ● 在一塊愈傷組織中或一張切片上可觀察到多個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的體細(xì)胞胚。 (5) ABA合成抑制劑不僅降低內(nèi)源 ABA 含量 ,而且抑制體細(xì)胞胚胎發(fā)生。mol 球形胚 梨形胚 香蕉形胚 子葉分化期胚 成熟胚 103 103 103 103 103 淀 粉 粒 初期 發(fā)育中的 二細(xì)胞 多細(xì)胞 球形胚 成熟胚 胚性細(xì)胞 胚性細(xì)胞 原胚 原胚 ? 小麥體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中淀粉粒消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)與小麥合子胚基本一致； ? 單子葉與雙子葉植物體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中淀粉粒消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)趨勢(shì)相似； 應(yīng)用 3H胸苷 (3H dT)標(biāo)記 ,放射自顯影方法研究表明 :愈傷組織轉(zhuǎn)入 “ 胚發(fā)生培養(yǎng) ” 4h后，標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)和標(biāo)記量逐漸增加，到 “ 球形胚 ” 時(shí) DNA合成速率達(dá)到最高峰 . ● 隨著體細(xì)胞胚的發(fā)育 ,DNA合成明顯增加 : 8 8 2 2 (1) 胚性愈傷組織 (EC)的內(nèi)源激