【正文】 NMTTTTTTTTT TT 3’ 5’ a b 5’端隨機(jī)引物 C NMTTTTTTTTT TT 3’端錨定引物 (5’T11MN3’) PCR 5’隨機(jī)引物 放射性標(biāo)記 dNTPs NMTTTTTTTTT TT D cDNA ● 優(yōu)點： ① 可以同時比較多個樣品間基因表達(dá)的差異； ②可以同時檢測到 “ 上游 ” 及 “ 下游 ” 基因； ③檢測靈敏度高 ,所需樣品少 ,經(jīng)過 PCR擴(kuò)增一些 低豐度的 mRNA也可以被檢測出來； ④結(jié)合使用了 PCR和序列膠電泳分析兩項技術(shù) ,使 本法具有高效性。 從細(xì)胞中提取 RNA 體外翻譯系統(tǒng) + 除 Met外的 19 種氨基酸 +MgAc2+KAc+[35S]Met 30℃ 溫浴 蛋白質(zhì) 免疫沉淀或 SDS聚丙烯酰胺 凝膠電泳進(jìn)行分析 (1)蛋白質(zhì)的雙向電泳 雙向電泳是將等電聚焦 IEF 和 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合 起來 ,依據(jù)蛋白質(zhì)的 等電點 和 分子量 來分辨蛋白質(zhì)有關(guān)信息的 技術(shù)。 (2)Western雜交 Westem雜交是將蛋白質(zhì) 電泳、印跡、免疫測定融為 一體，用來檢測表達(dá)的產(chǎn)物 不具酶活性的特異蛋白質(zhì)表 達(dá)的技術(shù)。其測定的靈敏度極高和具有較強(qiáng)特異性，是研究基因表達(dá)十分有效的方法。 ● ELISA使用的酶應(yīng)具有特異性強(qiáng)、純度及比活高、室溫下穩(wěn)定、來源方便、價格便宜等優(yōu)點。 ◆ 啟動子 (Promotor)是指 RNA聚合酶識別并與之 結(jié)合 ,從而起始轉(zhuǎn)錄的一段特異性 DNA序列 ,包括 TATA盒（控制轉(zhuǎn)錄啟動的準(zhǔn)確性）與 CAT盒（調(diào)控 轉(zhuǎn)錄的起始頻率）兩部分序列。 找到調(diào)控元件存在的區(qū)域 從該區(qū)域的 5’ 端作小范圍的缺失突變 ,或從該區(qū)域中間的不同部位造成缺 失突變 找出調(diào)控元件存在的準(zhǔn)確位點 人工合成此位點內(nèi)的核苷酸序列 ,或?qū)⒋诵蛄兄械膫€別核苷酸調(diào)換 ,或?qū)⑦@段 序列與突變后的序列分別連接在基礎(chǔ)啟動子上游 檢測它們是否能調(diào)節(jié)報告基因的表達(dá) (transacting factor) ● 反式作用因子是指那些結(jié)合到順式作用元件上特 異 DNA序列，并相互作用而實現(xiàn)其調(diào)節(jié)效應(yīng)的 蛋白質(zhì) 因子 ，它們可以增強(qiáng)或阻遏基因的表達(dá) ,或者決定著基 因表達(dá)的組織與發(fā)育階段專一性。 左圖 右圖 ② 鋅指 (Zinc finger)結(jié)構(gòu) 由多個重復(fù)的結(jié)構(gòu)組成，每個 分子中結(jié)合有 711個鋅原子， 每 2個半胱氨酸（ Cys）和 2個 組氨酸（ His）與一個 Zn原子結(jié) 合形成鋅指，一個完整的分子 可形成多個“指頭”，這有利于 DNA結(jié)合。 二是激活功能區(qū)與其他轉(zhuǎn)錄因子 （ TFⅡD ）作用，然后再作用于 RNA聚合酶。 A G T A A i p 反密碼子 tRNA (2)生長素對基因表達(dá)的調(diào)控 ● 植物生長素能誘導(dǎo) mRNA的合成，而且能調(diào)控細(xì)胞內(nèi) mRNA的含量水平： ◆ 已克隆出幾個受植物生長素誘導(dǎo)的 mRNA的 cDNA ◆ 2,4D可以誘導(dǎo)苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生中編碼富含脯氨酸的小分子蛋白質(zhì)基因 (MsPRP5)的表達(dá)；用 100 μmol/L 的 2,4D處理愈傷組織 20min，其 MsPRPS 的mRNA量開始增加 ,處理 2448h， mRNA的量達(dá)到峰值。 (2)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合 DNA的能力： ● CMyc是一種核磷酸化蛋白 ,它被磷酸化后就失去 結(jié)合 DNA的能力 ,不能激活基因的轉(zhuǎn)錄。 (2)特異 DNA序列的甲基化降低基因表達(dá)活性： ● 不活動或持續(xù)失活的基因甲基化程度較高 ,活躍 的或持續(xù)表達(dá)的基因常是低甲基化的；而具有組織 特異性表達(dá)的基因 5’ 端上游常呈低甲基化狀態(tài)。 原因 : ◆ 甲基化影響 DNA與蛋白質(zhì)的相互識別與作用；◆ 甲基化影響 DNA的構(gòu)象。 思考題： 1． 花粉小孢子離體發(fā)育的基本途徑及其主要特點？ 2. 體細(xì)胞離體再生的基本類型及特點？ 3．胚性細(xì)胞分裂不同步性的可能原因是什么 ?有什么克服的方法 ? 4．體細(xì)胞胚胎發(fā)生的基本過程及其特點？ 5. 花粉小孢子離體發(fā)育的 A、 B、 C途徑及其特點？ ? 7．胚性細(xì)胞形成過程中主要的生化變化 ? 8．體細(xì)胞胚起源的普遍觀點是什么 ?有何特點 ? 9．體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為胚性細(xì)胞的漸變理論的基本觀點是什么 ? 10．為什么體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中易發(fā)生遺傳變異 ,而且具有普遍性 ? 11．影響體細(xì)胞胚胎發(fā)生變異性的主要因素是什么 ? 12．參與腋芽和分生組織發(fā)育的基因的類型與種類？ 13. KNOX基因的生物學(xué)與莖尖組織發(fā)育的關(guān)系？ ? 13. 何謂螺旋 轉(zhuǎn)角 螺旋、鋅指和亮氨酸拉鏈？ 14. 蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化對基因轉(zhuǎn)錄有和調(diào)節(jié)作用 ? 15. 體細(xì)胞胚發(fā)生中 DNA的甲基化對基因表達(dá)有何調(diào)控作用 ? 被子植物生活史 。因此 ,激活了相應(yīng)基因的表達(dá)。 ● 培養(yǎng)細(xì)胞的分化率一般需要誘導(dǎo)，就是因為其甲基化程度較高，抑制了培養(yǎng)細(xì)胞中胚性相關(guān)基因的表達(dá)； 而通過激素、光溫條件等條件的誘導(dǎo)，降低 DNA甲基化程度，胚性相關(guān)基因才能表達(dá)，胚性細(xì)胞才能形成并進(jìn)一步發(fā)育。 (3)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活功能 ： 133位絲氨酸 CREB轉(zhuǎn)錄因子 133位絲氨酸 磷酸化 CREB轉(zhuǎn)錄因子 蛋白質(zhì)激酶 A cAMP mRNA 激活功能區(qū) 5. DNA的甲基化對基因表達(dá)的調(diào)控作用 (1) DNA甲基化 (methylation)的基本特點： ● DNA甲基化是基因組的特征，細(xì)胞內(nèi)甲基化過程 發(fā)生在 DNA合成以后，通常以半保留方式進(jìn)行 DNA 修 飾，即雙鏈 DNA中僅對新合成鏈的對應(yīng)位點 胞嘧啶 殘基 進(jìn)行甲基化修飾 :特別是在鳥嘌呤 (G)旁邊的 C 上： 539。在體細(xì)胞胚胎發(fā)生 過程中： ● ABA能誘導(dǎo)一些特異性蛋白質(zhì)的合成： 如種子貯藏蛋白等； ● 調(diào)節(jié)某些科植物胚胎發(fā)生特異性基因的表達(dá)： 在轉(zhuǎn)化的水稻原生質(zhì)體中，用 ABA誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)入水稻的小麥胚 胎發(fā)生相關(guān)基因啟動子 (Em)的轉(zhuǎn)錄。 ● 細(xì)胞分裂素可調(diào)控蛋白質(zhì)的磷酸化； ● 細(xì)胞分裂素還可調(diào)控蛋白質(zhì)的翻譯： 例如 ， 一種稱為 異戊間二烯腺嘌呤 (ipA)細(xì)胞分裂 素存在于 tRNA分子的反密碼子鄰近處。 ③ 亮氨酸拉鏈(leucine zipper)結(jié)構(gòu) (2)激活功能區(qū) 轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活功能區(qū)一般 由 30個到 150個氨基酸組成，其結(jié) 構(gòu)主要有三種類型： 酸性功能區(qū)、 谷氨酰胺豐富功能區(qū)和脯氨酸豐富 功能區(qū)。 ● 轉(zhuǎn)錄因子的作用方式 研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子通常由 DNA結(jié)合區(qū) 和 轉(zhuǎn)錄激活 區(qū) 兩個功能區(qū)組成。增強(qiáng)子的結(jié)構(gòu)與啟動子非 常相似 , 其功能是結(jié)合特定的轉(zhuǎn)錄因子或影響 DNA 構(gòu)象。 三 .體細(xì)胞胚發(fā)生中基因表達(dá)的調(diào)控 ● 順式作用元件 (cisacting element)： 是指基因 5’ 端上游區(qū)中那些與基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)的 DNA序列，包括一般基因都有的 TATA box與 CAATbox 和一些重要的調(diào)控元件。② 抗體或抗原的包被；③免疫反應(yīng)及檢出。 根據(jù)檢出結(jié)果 ,可得知被檢植物細(xì)胞內(nèi)目的蛋白表達(dá)與否 ,濃度高低及大致的分子量 。 ◆ 利用該技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿體細(xì)胞胚發(fā)生中的特異蛋白質(zhì) — 50kD蛋白質(zhì)，是等電點不同而分子量相同的三種蛋白質(zhì) ,在非胚性愈傷組織中缺乏這種蛋白質(zhì)； ◆ 在胡蘿卜的體細(xì)胞胚發(fā)生研究中得到了伴隨 2,4D的加入而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。 優(yōu)點： 可以探討體內(nèi)翻譯后產(chǎn)生