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植物細(xì)胞工程制藥(文件)

2025-03-04 12:28 上一頁面

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【正文】 丙烯酰紫草素等。 ? 紫草寧產(chǎn)生于亞洲的多年生 植物紫草的根部 。 ? 紫草寧在國際市場上售價高達(dá) 7000美元 /kg ? 1974年 Tabata等就研究了用于培養(yǎng)紫草細(xì)胞的培養(yǎng)基。 ? B5,N6,MG5,LS培養(yǎng)基 ? PH ? 生物誘導(dǎo)子 ? 生長素與激動素 ? 25度 ? 暗培養(yǎng) ? 兩步培養(yǎng)法 ? 使用兩個生物反應(yīng)器,第一個用于細(xì)胞生物量的累積 (適合細(xì)胞生長的培養(yǎng)基,營養(yǎng)豐富 ),第二個用于次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn) (較低含量的硝酸鹽和磷酸鹽,并含有較低的糖分或少量的碳源 ) ? 日本科學(xué)家用此方法開發(fā)了第一個 植物細(xì) 胞工程產(chǎn)品 —— 紫草寧 ? 通過提高第二個反應(yīng)器中的 Ca2+濃度,大幅度增加了培養(yǎng)液中的紫草素含量 二、生產(chǎn)抗體、重組疫苗、多肽類藥物 ? 上游生產(chǎn)成本低 ? 獲取的遺傳性質(zhì)穩(wěn)定 ? 自然條件下易于生長,管理 ? 植物作為生物反應(yīng)器,可省去下游提取,廉價生產(chǎn) ? 蛋白在植物中多數(shù)正確折疊,保證生物活性的穩(wěn)定 利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)抗體 ? 表達(dá)抗體的關(guān)鍵是抗體片段 正確組裝和糖基化 等后修飾。 ? 目前研究發(fā)現(xiàn)苜??僧a(chǎn)生單一糖型的抗體,它有望成為更為合適的表達(dá)系統(tǒng)。分泌抗體,如 sIgAG植物抗體,在美國已經(jīng)運用于臨床試驗。 利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)疫苗 ? 自 92年, HBsAg基因轉(zhuǎn)入煙草中表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物可糖基化、酰胺化、磷酸化及可完成對亞基的正確裝配等翻譯后加工過程,使表達(dá)產(chǎn)物具有與高等動物細(xì)胞一致的免疫原性 ? 不足之處: ? 轉(zhuǎn)基因植物中重組蛋白 含量低 ? 植物外源蛋白的提取和純化還沒有達(dá)到產(chǎn)業(yè)化水平,還停留在實驗室水平。 ? 表 57 利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)其他藥物 ? 盡管在利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)人源蛋白或多肽已取得了很大的進展,但在生產(chǎn)實踐中仍然面臨的主要問題是外源基因的表達(dá)水平低的問題,一般來說,在臨床應(yīng)用中需要純化的重組蛋白表達(dá)量應(yīng)占轉(zhuǎn)化細(xì)胞 TSP (總可溶性蛋白 )的 1 %以上時才具有商業(yè)價值 。 ? 目前轉(zhuǎn)基因植物普遍存在目的基因產(chǎn)物產(chǎn)出率低、基因沉默或不穩(wěn)定表達(dá)的現(xiàn)象,這已成為轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)技術(shù)的主要障礙。 轉(zhuǎn)基因植物目前仍存在的問題 ? 產(chǎn)量偏低、糖基化不可靠性 、生物安全性和公眾接受性以及工業(yè)化技術(shù)問題; ? 技術(shù)上的問題。 ? 人體內(nèi)含有甚微但具有重要臨床價值的蛋白或多肽也可在植物系統(tǒng)中表達(dá)。 ? 轉(zhuǎn)基因植物將打破傳統(tǒng)的疫苗或功能蛋白的生產(chǎn)方式.以大田栽培的方式取而代之。這包括煙草中表達(dá)的單個結(jié)構(gòu)域抗體、單鏈抗體分子。第一個在植物中表達(dá)的抗體是 IgG1,通過雜交繁殖的煙草表達(dá)其重鏈及輕鏈構(gòu)成完整的抗體,圖 513 。 ? 植物中的糖基化同時包括 N及 O糖基化,和動物稍有不同,植物的糖基化更具有異質(zhì)性 ,不同植物產(chǎn)生的糖基化末端不相同,即使是同一株植物不同時期產(chǎn)生的糖基末端仍有不同。 ? 日本在 1983年進行紫草細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)來生產(chǎn)紫草寧。 ? 紫草的人工栽培成活率低,而且直接提取紫草寧的無法滿足市場需求。 ? 功能主治 涼血,活血,解毒透疹。 ? 用植物組織培養(yǎng)反應(yīng)器 (10L規(guī)模 )進行了丹參發(fā)根培養(yǎng)的研究 , 發(fā)現(xiàn)丹參發(fā)根在 50天內(nèi)鮮重增殖倍數(shù)可高達(dá) 240倍左右 ,丹參酮、丹酚酸 A的含量也相當(dāng)高,非常適合于丹參發(fā)根的生長及丹參酮的積累 ,而且利用此系統(tǒng)生產(chǎn)出的丹參及其有效成分由于不受農(nóng)藥等污染物的影響 ,具有廣闊的市場前景。 ? 紫杉醇存在于紅豆杉屬植物的樹皮、葉及莖中, 其中樹皮中的含量最高。 導(dǎo)入植物的目的基因是否轉(zhuǎn)入其他植物,是否會破壞生態(tài)平衡。 ②當(dāng)加入 4甲基傘形酮基和葡萄糖苷酸時生成 4甲基傘形酮,發(fā)熒光( λ=465nm )。 ? :由未分化的細(xì)胞直接分化形成,體細(xì)胞元件系變異小,導(dǎo)入的外源基因可穩(wěn)定遺傳。 ? 缺點:遺傳穩(wěn)定性差、嵌合體。 種質(zhì)轉(zhuǎn)化系統(tǒng) 是以植物自身的生殖系統(tǒng)種質(zhì)細(xì)胞為受體進行的轉(zhuǎn)化,如花粉浸泡外源 DNA、 DNA注射受粉后的子房等; 花粉管通道法 :利用植物在受精和胚發(fā)育初期接受外源 DNA的敏感性 DNA轉(zhuǎn)化花粉 ,下柱頭,外源 DNA滴在柱頭,沿花粉管道進入胚囊,轉(zhuǎn)化受精前后的卵細(xì)胞 常用植物基因轉(zhuǎn)化方法特點比較 轉(zhuǎn)化方法 農(nóng)桿菌法 PEG法 電擊法 微針注射法 基因槍法 花粉管通道法 受體材料 完整細(xì)胞 原生質(zhì)體 原生質(zhì)體 原生質(zhì)體 完整細(xì)胞 卵細(xì)胞 宿主范圍 有 無 無 無 無 有性繁殖植物 組培條件 簡單 復(fù)雜 復(fù)雜 復(fù)雜 簡單 無 嵌合體比例 有 無 無 無 多 無 操作復(fù)雜性 簡單 簡單 復(fù)雜 復(fù)雜 復(fù)雜 簡單 設(shè)備要求 便宜 便宜 昂貴 昂貴 昂貴 便宜 工作效率 高 低 低 低 高 低 單子葉植物應(yīng)用 少 可行 可行 可行 廣泛 廣泛 (三)受體系統(tǒng) ? :嵌合體 少,易變異,再生頻率低 ? 原生質(zhì)體恢復(fù)細(xì)胞壁具有分化再生能力,是應(yīng)用最早的再生受體系統(tǒng)之一。而基因槍沒有物種限制。 ? 其基本原理是將外源 DNA包被在微小的金?;蜴u粒表面,然后在高壓的作用下微粒被高速射入受體細(xì)胞或組織。顯微注射的一個重要問題是必須把受體細(xì)胞進行固定。 (3)植物病毒載體 ? 病毒載體只要與植物細(xì)胞共培養(yǎng)就可以較高地感染植物細(xì)胞;且外源基因能在植物細(xì)胞中快速復(fù)制和高水平表達(dá)。該區(qū)中含有與毛狀根形成有關(guān)的 rolA、 B、 C、D基因群。 ( 2)發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化 ? Ri質(zhì)粒為根誘導(dǎo)質(zhì)粒。 TDNA區(qū)域內(nèi)的所有基因與轉(zhuǎn)移無關(guān),將致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后,將其它序列插入到這個區(qū)域,形成的TDNA仍可將 RB至 LB內(nèi)的序列轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組。 ? 細(xì)胞分裂素基因( cyt),突變將引起易生根特性。 ? Ti質(zhì)粒具有兩個區(qū)域, TDNA和 毒性區(qū)域 (vir) ? 還具有冠癭堿代謝 (opine catabolism)、復(fù)制原點 (ori) 。 (1)根癌農(nóng)桿菌 轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。 ? 雖然在早期采用這種方式已經(jīng)成功地克隆了許多基因。 ? 1986年 ,首批轉(zhuǎn)基因植物 抗蟲和抗除草劑棉花進入田間試驗。 ? 毛狀根生長快速和次級代謝產(chǎn)物含量高,特別適用于從木本植物和難于培養(yǎng)的植物中得到較高含量的次級代謝產(chǎn)物。條件培養(yǎng)基指培養(yǎng)過細(xì)胞的培養(yǎng)基上清,有植物生長激素等殘留,用于制備成固體培養(yǎng)基。 ? 一般來說,懸
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