【正文】 ? 目前轉(zhuǎn)基因植物普遍存在目的基因產(chǎn)物產(chǎn)出率低、基因沉默或不穩(wěn)定表達(dá)的現(xiàn)象，這已成為轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)技術(shù)的主要障礙。 轉(zhuǎn)基因植物目前仍存在的問(wèn)題 ? 產(chǎn)量偏低、糖基化不可靠性 、生物安全性和公眾接受性以及工業(yè)化技術(shù)問(wèn)題； ? 技術(shù)上的問(wèn)題。 ? 表 57 利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)其他藥物 ? 盡管在利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)人源蛋白或多肽已取得了很大的進(jìn)展，但在生產(chǎn)實(shí)踐中仍然面臨的主要問(wèn)題是外源基因的表達(dá)水平低的問(wèn)題，一般來(lái)說(shuō)，在臨床應(yīng)用中需要純化的重組蛋白表達(dá)量應(yīng)占轉(zhuǎn)化細(xì)胞 TSP (總可溶性蛋白 )的 1 %以上時(shí)才具有商業(yè)價(jià)值 。 ? 人體內(nèi)含有甚微但具有重要臨床價(jià)值的蛋白或多肽也可在植物系統(tǒng)中表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物可糖基化、酰胺化、磷酸化及可完成對(duì)亞基的正確裝配等翻譯后加工過(guò)程，使表達(dá)產(chǎn)物具有與高等動(dòng)物細(xì)胞一致的免疫原性 ? 不足之處： ? 轉(zhuǎn)基因植物中重組蛋白 含量低 ? 植物外源蛋白的提取和純化還沒(méi)有達(dá)到產(chǎn)業(yè)化水平，還停留在實(shí)驗(yàn)室水平。 ? 轉(zhuǎn)基因植物將打破傳統(tǒng)的疫苗或功能蛋白的生產(chǎn)方式．以大田栽培的方式取而代之。 利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)疫苗 ? 自 92年， HBsAg基因轉(zhuǎn)入煙草中表達(dá)。這包括煙草中表達(dá)的單個(gè)結(jié)構(gòu)域抗體、單鏈抗體分子。分泌抗體，如 sIgAG植物抗體，在美國(guó)已經(jīng)運(yùn)用于臨床試驗(yàn)。第一個(gè)在植物中表達(dá)的抗體是 IgG1，通過(guò)雜交繁殖的煙草表達(dá)其重鏈及輕鏈構(gòu)成完整的抗體，圖 513 。 ? 目前研究發(fā)現(xiàn)苜蓿可產(chǎn)生單一糖型的抗體，它有望成為更為合適的表達(dá)系統(tǒng)。 ? 植物中的糖基化同時(shí)包括 N及 O糖基化，和動(dòng)物稍有不同，植物的糖基化更具有異質(zhì)性 ，不同植物產(chǎn)生的糖基化末端不相同，即使是同一株植物不同時(shí)期產(chǎn)生的糖基末端仍有不同。 ? B5,N6,MG5,LS培養(yǎng)基 ? PH ? 生物誘導(dǎo)子 ? 生長(zhǎng)素與激動(dòng)素 ? 25度 ? 暗培養(yǎng) ? 兩步培養(yǎng)法 ? 使用兩個(gè)生物反應(yīng)器，第一個(gè)用于細(xì)胞生物量的累積 (適合細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)豐富 )，第二個(gè)用于次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn) (較低含量的硝酸鹽和磷酸鹽，并含有較低的糖分或少量的碳源 ) ? 日本科學(xué)家用此方法開發(fā)了第一個(gè) 植物細(xì) 胞工程產(chǎn)品 —— 紫草寧 ? 通過(guò)提高第二個(gè)反應(yīng)器中的 Ca2+濃度，大幅度增加了培養(yǎng)液中的紫草素含量 二、生產(chǎn)抗體、重組疫苗、多肽類藥物 ? 上游生產(chǎn)成本低 ? 獲取的遺傳性質(zhì)穩(wěn)定 ? 自然條件下易于生長(zhǎng)，管理 ? 植物作為生物反應(yīng)器，可省去下游提取，廉價(jià)生產(chǎn) ? 蛋白在植物中多數(shù)正確折疊，保證生物活性的穩(wěn)定 利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)抗體 ? 表達(dá)抗體的關(guān)鍵是抗體片段 正確組裝和糖基化 等后修飾。 ? 日本在 1983年進(jìn)行紫草細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)紫草寧。 ? 紫草寧在國(guó)際市場(chǎng)上售價(jià)高達(dá) 7000美元 /kg ? 1974年 Tabata等就研究了用于培養(yǎng)紫草細(xì)胞的培養(yǎng)基。 ? 紫草的人工栽培成活率低，而且直接提取紫草寧的無(wú)法滿足市場(chǎng)需求。 ? 紫草寧產(chǎn)生于亞洲的多年生 植物紫草的根部 。 ? 功能主治 涼血，活血，解毒透疹。 (4)紫草細(xì)胞培養(yǎng) ? 化學(xué)成分 :含乙酰紫草素、 β 羥基異戊酰紫草素、紫草素、β ， β ’二甲基丙烯酰紫草素等。 ? 用植物組織培養(yǎng)反應(yīng)器 (10L規(guī)模 )進(jìn)行了丹參發(fā)根培養(yǎng)的研究 , 發(fā)現(xiàn)丹參發(fā)根在 50天內(nèi)鮮重增殖倍數(shù)可高達(dá) 240倍左右 ,丹參酮、丹酚酸 A的含量也相當(dāng)高，非常適合于丹參發(fā)根的生長(zhǎng)及丹參酮的積累 ,而且利用此系統(tǒng)生產(chǎn)出的丹參及其有效成分由于不受農(nóng)藥等污染物的影響 ,具有廣闊的市場(chǎng)前景。 ? 紫杉醇的國(guó)際市場(chǎng)價(jià)格為450美元 /g ? B5培養(yǎng)基，補(bǔ)糖，暗培養(yǎng) ? 低濃度的生長(zhǎng)激素 ? 誘導(dǎo)子 ? 培養(yǎng)基中加甲基戊酸，苯丙氨酸等前體 ? 加甲瓦龍酸等中間產(chǎn)物 ? 加單萜合成抑制劑 ? 篩選細(xì)胞株 ? 最高產(chǎn)量達(dá) (3)丹參發(fā)根生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) ? 丹參 (Salvia miltiorrhiza) ：活血化淤 ,通經(jīng)止痛 . ? 丹參中含有二類活性成分 : 脂溶性二萜醌類化合物和水溶性酚酸類化合物 .具有抑制血小板聚集、耐缺氧、改善冠狀動(dòng)脈供血等藥理作用 ,是治療心血管系統(tǒng)疾病的重要藥物。 ? 紫杉醇存在于紅豆杉屬植物的樹皮、葉及莖中， 其中樹皮中的含量最高。 ? 1967年美國(guó)化學(xué)家 Wall和 Wani首先從太平洋紫 杉（短葉紅豆杉）樹皮中提取出來(lái)。 導(dǎo)入植物的目的基因是否轉(zhuǎn)入其他植物，是否會(huì)破壞生態(tài)平衡。由于熒光強(qiáng)度高，本底低，故熒光檢測(cè)極為靈敏。 ②當(dāng)加入 4甲基傘形酮基和葡萄糖苷酸時(shí)生成 4甲基傘形酮，發(fā)熒光（ λ=465nm ）。 （四）表達(dá)和分析 ? 基因水平的檢測(cè)： RE分析， DNA序列分析，PCR， Southern Blot，RFLP， RAPD等。 ? ：由未分化的細(xì)胞直接分化形成，體細(xì)胞元件系變異小，導(dǎo)入的外源基因可穩(wěn)定遺傳。 ? 一是利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行小孢子和卵細(xì)胞的單倍體培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)； ? 二是直接利用花粉和卵細(xì)胞受精過(guò)程進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，如花粉管導(dǎo)入法，花粉粒浸泡法，子房微針注射法等。 ? 缺點(diǎn)：遺傳穩(wěn)定性差、嵌合體。 ? ： 植體材料經(jīng)過(guò)脫分化培養(yǎng)誘導(dǎo)形成愈傷組織，轉(zhuǎn)化（帶有目的基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染），分化培養(yǎng)獲得再生植株。 種質(zhì)轉(zhuǎn)化系統(tǒng) 是以植物自身的生殖系統(tǒng)種質(zhì)細(xì)胞為受體進(jìn)行的轉(zhuǎn)化，如花粉浸泡外源 DNA、 DNA注射受粉后的子房等； 花粉管通道法 ：利用植物在受精和胚發(fā)育初期接受外源 DNA的敏感性 DNA轉(zhuǎn)化花粉 ，下柱頭，外源 DNA滴在柱頭，沿花粉管道進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化受精前后的卵細(xì)胞 常用植物基因轉(zhuǎn)化方法特點(diǎn)比較 轉(zhuǎn)化方法 農(nóng)桿菌法 PEG法 電擊法 微針注射法 基因槍法 花粉管通道法 受體材料 完整細(xì)胞 原生質(zhì)體 原生質(zhì)體 原生質(zhì)體 完整細(xì)胞 卵細(xì)胞 宿主范圍 有 無(wú) 無(wú) 無(wú) 無(wú) 有性繁殖植物 組培條件 簡(jiǎn)單 復(fù)雜 復(fù)雜 復(fù)雜 簡(jiǎn)單 無(wú) 嵌合體比例 有 無(wú) 無(wú) 無(wú) 多 無(wú) 操作復(fù)雜性 簡(jiǎn)單 簡(jiǎn)單 復(fù)雜 復(fù)雜 復(fù)雜 簡(jiǎn)單 設(shè)備要求 便宜 便宜 昂貴 昂貴 昂貴 便宜 工作效率 高 低 低 低 高 低 單子葉植物應(yīng)用 少 可行 可行 可行 廣泛 廣泛 （三）受體系統(tǒng) ? :嵌合體 少，易變異，再生頻率低 ? 原生質(zhì)