植物細(xì)胞工程制藥-文庫(kù)吧
2025-02-10 12:28 本頁(yè)面
【正文】 生長(zhǎng)素 和 分裂素 的比例： ? 高濃度生長(zhǎng)素和低濃度分裂素 —— 刺激細(xì)胞 分裂 ? 低濃度生長(zhǎng)素和高濃度分裂素 —— 刺激細(xì)胞 生長(zhǎng) ? （三）誘導(dǎo)子 (elicitor)： 刺激植物細(xì)胞合成 防御性次生代謝產(chǎn)物 的物質(zhì) , 可以通過(guò)改變次生代謝途徑中催化酶的 酶活力 ,引起代謝通量和反應(yīng)速率的改變 , 提高次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。 ? 非生物誘導(dǎo)子 ：水楊酸，茉莉酸等 ,稀土及重金 屬鹽類(lèi) ? 生物誘導(dǎo)子 ：微生物類(lèi)，如真菌孢子，菌絲體 真菌培養(yǎng)物濾液等 ? （四）碳源 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中不進(jìn)行光合作用，需提供糖做碳源。 ? （五） 維生素：煙酸， B1， B6 ? （六）有機(jī)物：甘氨酸或水解絡(luò)蛋白，酵母提取 液等。 三、植物細(xì)胞生物反應(yīng)器 ? 植物細(xì)胞易聚集化，比較脆弱，代謝途徑和代謝產(chǎn)物累積與細(xì)胞生長(zhǎng)關(guān)系的復(fù)雜性，選擇合適的培養(yǎng)方法和反應(yīng)器影像產(chǎn)物產(chǎn)量 ? 細(xì)胞培養(yǎng)周期長(zhǎng)，次生代謝產(chǎn)物含量相對(duì)較低，提取困難，生物反應(yīng)器技術(shù)還有待深入 各種生物反應(yīng)器性能比較 ? 不同類(lèi)型的生物反應(yīng)器各有其優(yōu)缺點(diǎn)，而改進(jìn)的攪拌式生物反應(yīng)器和氣升式反應(yīng)器可能更適合植物細(xì)胞的培養(yǎng)。 ? 一般來(lái)說(shuō)，懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞在干重不大于 20g/L時(shí)，以氣升式反應(yīng)器為宜，而當(dāng)干重超過(guò) 20g/L時(shí)，則改進(jìn)的攪拌式生物反應(yīng)器優(yōu)于其它類(lèi)型的反應(yīng)器 ? 我國(guó)發(fā)明的 “ 氣升內(nèi)錯(cuò)流 ” 式植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器，能夠適應(yīng)植物細(xì)胞培養(yǎng)周期長(zhǎng)，培養(yǎng)液隨培養(yǎng)進(jìn)程而蒸發(fā)減少的生物反應(yīng)過(guò)程；可抑制氣泡的聚合，減弱氣泡在液面破裂時(shí)產(chǎn)生的沖擊力對(duì)細(xì)胞的損傷；可提高降液區(qū)氣含率，消除降液區(qū)缺氧現(xiàn)象，并強(qiáng)化混合與氧傳遞，大大降低反應(yīng)器高度。 ? 使用這種反應(yīng)器培養(yǎng)新疆紫草細(xì)胞，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)細(xì)胞量達(dá)到 12gdw／ L，紫草寧含量達(dá)到了細(xì)胞干重的 10％，是天然植株含量的 2～ 8倍 四、植物細(xì)胞的獲得和擴(kuò)大培養(yǎng) （一）植物細(xì)胞的獲得 ? 法 :機(jī)械切割、組織破碎直接從植物外植體中分離 ? 法：從愈傷組織制備小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞懸液 ? 法： 纖維素和果膠酶 混合處理外植體或愈傷組織，分離原生質(zhì)體，再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)，原生質(zhì)體細(xì)胞壁再生獲得植物細(xì)胞 （二）植物細(xì)胞的培養(yǎng)方法 ? （ 1） 看護(hù)培養(yǎng)法 （ nurse culture） ：在單細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境里加入愈傷組織同時(shí)培養(yǎng)。愈傷組織提供促細(xì)胞分裂的物質(zhì)等，傳遞生物信息，使持續(xù)分裂增值等。 ? 即愈傷組織看護(hù)單細(xì)胞 ? （ 2） 微室培養(yǎng)法 ：?jiǎn)渭?xì)胞接種到小室里，密封培養(yǎng)，觀測(cè)單細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育情況 ? （ 3） 平板培養(yǎng)法 ：?jiǎn)渭?xì)胞接種于固體培養(yǎng)基上，獲得單細(xì)胞形成的細(xì)胞系 ? （ 4） 條件培養(yǎng)法 ：接種于條件培養(yǎng)基上形成的細(xì)胞系。條件培養(yǎng)基指培養(yǎng)過(guò)細(xì)胞的培養(yǎng)基上清，有植物生長(zhǎng)激素等殘留，用于制備成固體培養(yǎng)基。 （花藥培養(yǎng)）：指將植物單倍體細(xì)胞培養(yǎng)成單倍體植株或純和二倍體植株 ? 一般采取花藥作為單倍體細(xì)胞的培養(yǎng)對(duì)象 ? 用花粉在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng) ? 愈傷組織既是組織又是細(xì)胞，為脫分化細(xì)胞，具再分化的能力，可用于次生代謝物的生產(chǎn)，也可再生為植株。 ? 一些次生代謝產(chǎn)物只有在根里生長(zhǎng) ? 發(fā)根農(nóng)桿菌感染雙子夜植物， RI質(zhì)粒誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根。 ? 形態(tài)方面： Ri質(zhì)粒誘導(dǎo)快速生長(zhǎng)的、非定向性、高分支的毛狀根的形成 ? 代謝方面： Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根能合成與原植物相同或相似的次生代謝物，并且發(fā)根合成次生代謝物具有遺傳穩(wěn)定性。 ? 毛狀根生長(zhǎng)快速和次級(jí)代謝產(chǎn)物含量高，特別適用于從木本植物和難于培養(yǎng)的植物中得到較高含量的次級(jí)代謝產(chǎn)物。 ? 毛狀根具有如下特點(diǎn)： ? 激素自養(yǎng) ，不必加外源激素； ? 次級(jí)代謝產(chǎn)物含量 高 且 穩(wěn)定 ； ? 增殖速度 快 。 ? 用 發(fā)根農(nóng)桿菌經(jīng) 直接注射法，外植體接種感染，原生質(zhì)體共培養(yǎng)法誘導(dǎo)毛狀根 ? 發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后，經(jīng)篩選鑒定 ? 低鹽濃度下生長(zhǎng)，培養(yǎng) 植物細(xì)胞培養(yǎng)工業(yè)化存在的問(wèn)題 ? 生長(zhǎng)緩慢 ,通常完成一次生產(chǎn)周期需 45周 ? 次級(jí)代謝物含量低 ? 培養(yǎng)細(xì)胞不穩(wěn)定等 ? 多數(shù)產(chǎn)物積累于胞內(nèi) ? 不耐受剪切力 ? 一般的說(shuō)，只有當(dāng)次級(jí)代謝產(chǎn)物的價(jià)格高于 1000美元 /kg時(shí)，才考慮采用植物細(xì)胞培養(yǎng)方法。 第三節(jié) 轉(zhuǎn)基因植物 一、轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生和發(fā)展 （一）轉(zhuǎn)基因植物的基本概念 ? 轉(zhuǎn)基因植物： 遺傳修飾體 (geically modified anisms, GMOs) ? 近年發(fā)展迅速 ? 應(yīng)用廣泛 ? 世界第一例轉(zhuǎn)基因植物 煙草 1983年在美國(guó)問(wèn)世。 ? 1986年 ,首批轉(zhuǎn)基因植物 抗蟲(chóng)和抗除草劑棉花進(jìn)入田間試驗(yàn)。 ? 1992年中國(guó)成為世界上第一個(gè)轉(zhuǎn)基因植物商品化種植的國(guó)家，開(kāi)創(chuàng)了轉(zhuǎn)基因植物商品化應(yīng)用的先河；當(dāng)時(shí)種植的是一種抗黃瓜花葉病毒和煙草花葉病毒雙價(jià)轉(zhuǎn)基因煙草。 （二）轉(zhuǎn)基因植物的幾大類(lèi)型 ? :除草作用的酶和蛋白質(zhì)基因 。以除草劑為底物的酶的基因轉(zhuǎn)移 ? :從細(xì)菌中、植物組織中和動(dòng)物體內(nèi)分離出相關(guān)抗性基因 ,轉(zhuǎn)入植物中 ? ? :抗旱、抗寒、抗熱和抗鹽 ? ? ? 二、轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)原理和方法 （一）基因獲得 ? （ 1）氨基酸序列反推核酸序列，合成探針，從基因組或 cDNA文庫(kù)中篩選 ? 利用這種方法人類(lèi)首次人工合成了胰島素基因。 ? 雖然在早期采用這種方式已經(jīng)成功地克隆了許多基因。 ? 局限性：兼并密碼子 。 效率低 。 未知基因及產(chǎn)物 分離蛋白質(zhì) 明確氨基酸序列 推導(dǎo)核苷酸序列 人工合成 ? （ 2）分離蛋白，制備抗體，用抗體從 cDNA表達(dá)文庫(kù)中篩選 ? （ 3）根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)信息，利用保守區(qū)域制備 PCR引物，進(jìn)行擴(kuò)增 ? （ 4）以其他物種的類(lèi)似基因?yàn)樘结槪s交分離相應(yīng)基因 （二）外源基因?qū)? 是目前植物基因工程中使用最多、機(jī)理最清楚、技術(shù)最成熟的、最重要的一種轉(zhuǎn)化系統(tǒng) Tumor induced by A. tumefaciens 冠癭瘤 ? 過(guò)程：先將帶有目的基因的質(zhì)粒整合到農(nóng)桿菌基因組中，再將此農(nóng)桿菌與植物細(xì)胞共同培養(yǎng) 36～48h，轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，然后分離洗滌去菌后通過(guò)組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植物或形成 冠癭瘤 和發(fā)狀根等組織，這些組織也就是一種天然的選擇標(biāo)記。 (1)根癌農(nóng)桿菌 轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。 含有 Ti質(zhì)
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