【正文】 但細(xì)胞壁脆弱，抗剪切能力小，傳統(tǒng)的攪拌式反應(yīng)器極易損傷細(xì)胞壁 二、植物細(xì)胞培養(yǎng)基 ? 植物細(xì)胞生長(zhǎng)代謝特點(diǎn)： ?（ 1）需大量無機(jī)鹽 ?（ 2）需多種維生素和植物生長(zhǎng)激素 ?（ 3）無機(jī)氮源，硝酸鹽，銨鹽為主。干重恒定，細(xì)胞數(shù)、DNA和蛋白質(zhì)濃度增加，有絲分裂活性、 RNA含量和蛋白質(zhì)合成能力減少； ? 對(duì)數(shù)期： 介于最大生長(zhǎng)率和蛋白質(zhì)合成完全停止期之間。 ? 已分化的細(xì)胞要表現(xiàn) 全能性 ，首先要脫分化形成分生細(xì)胞，然后再分化形成胚胎發(fā)育成植株 ? 脫分化條件： 創(chuàng)傷和外源激素 。 ? 之后至 30年代，建立了基本的植物組織培養(yǎng)技術(shù) 50年代期間，組織培養(yǎng)進(jìn)入新的階段 ? 培養(yǎng)基的設(shè)計(jì) ? 生物反應(yīng)器 ? 培養(yǎng)動(dòng)力學(xué)等 ? 用于次級(jí)代謝產(chǎn)物的 調(diào)控研究 ? 80年代后，高速發(fā)展時(shí)期 ? 分子生物學(xué)技術(shù)改變植物遺傳特性 ? 植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行有藥用價(jià)值的天然產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)和直接生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物成為主流 ? 目前，我國(guó)處于此方面的領(lǐng)先 二、植物細(xì)胞的藥用成分 ? 市售中成藥的 25%來源于植物提取藥物或半合成藥物 ? 一類為植物后含物，為細(xì)胞儲(chǔ)液或廢棄物，包括生物堿 、 揮發(fā)油 和 有機(jī)酸 。 ? 改變植物或植物細(xì)胞的原有性狀和功能 ，獲得具有優(yōu)良性狀的植株或植物細(xì)胞，生產(chǎn)有藥用價(jià)值的次生代謝產(chǎn)物 。 第一節(jié) 概述 利用組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)藥用成分 ? 植物組織及細(xì)胞培養(yǎng)過程中，所產(chǎn)生的次生代謝物常存在于細(xì)胞內(nèi)，可以收獲細(xì)胞進(jìn)行提取，因所含色素等 雜質(zhì)較少 ，所以提取過程相對(duì)于從原植物中 提取要簡(jiǎn)單 一些。 ? 一類為生理活性物質(zhì)，如 酶 、 維生素 、 植物激素 、植物殺菌素 等 三、植物細(xì)胞的生物學(xué)特性 ? 細(xì)胞的全能性 : 一個(gè)細(xì)胞所具有的產(chǎn)生完整生物個(gè)體的固有能力。 ? 外植體 (explant)：植物體上取出的用于培養(yǎng)和分離細(xì)胞的組織或器官 ? 愈傷組織 ：植物的傷口或外植體的傷口長(zhǎng)出的細(xì)胞團(tuán)，既是組織，又是脫分化細(xì)胞 Callus ? 毛狀根 (hairy root)：受到發(fā)根農(nóng)桿菌感染后形成的根組織，易于培養(yǎng)，改變了植物的次生代謝。增加細(xì)胞鮮重、干重及 RNA酶活性，蛋白質(zhì)合成能力完全減退； ? 穩(wěn)定期： 細(xì)胞數(shù)穩(wěn)定。 ?（ 4）以蔗糖為碳源 ? 培養(yǎng)基配方見表 53 常用培養(yǎng)基 ? MS、 N B LS、 RM196 H、 T、 B DBMII、米勒、改良懷特、尼許等。 ? B5含有較低的 鹽 離子 ， 這個(gè)成分可能對(duì)很多培養(yǎng)物的生長(zhǎng)有抑制作用 。 ? （一）無機(jī)鹽 ? 大量元素： 氮、磷、鉀、鈣、鎂、硫等 ? 微量元素： 硼、錳、鋅、鉬、銅、鈷、氯等 ? （二）生長(zhǎng)因素 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑 植物生長(zhǎng)激素： 生長(zhǎng)素 ， 細(xì)胞分裂素 ， 赤霉素，脫落酸 ， 乙烯。 ? （五） 維生素：煙酸， B1， B6 ? （六）有機(jī)物：甘氨酸或水解絡(luò)蛋白，酵母提取 液等。愈傷組織提供促細(xì)胞分裂的物質(zhì)等，傳遞生物信息，使持續(xù)分裂增值等。 ? 一些次生代謝產(chǎn)物只有在根里生長(zhǎng) ? 發(fā)根農(nóng)桿菌感染雙子夜植物， RI質(zhì)粒誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根。 ? 用 發(fā)根農(nóng)桿菌經(jīng) 直接注射法，外植體接種感染，原生質(zhì)體共培養(yǎng)法誘導(dǎo)毛狀根 ? 發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后，經(jīng)篩選鑒定 ? 低鹽濃度下生長(zhǎng)，培養(yǎng) 植物細(xì)胞培養(yǎng)工業(yè)化存在的問題 ? 生長(zhǎng)緩慢 ,通常完成一次生產(chǎn)周期需 45周 ? 次級(jí)代謝物含量低 ? 培養(yǎng)細(xì)胞不穩(wěn)定等 ? 多數(shù)產(chǎn)物積累于胞內(nèi) ? 不耐受剪切力 ? 一般的說，只有當(dāng)次級(jí)代謝產(chǎn)物的價(jià)格高于 1000美元 /kg時(shí)，才考慮采用植物細(xì)胞培養(yǎng)方法。 （二）轉(zhuǎn)基因植物的幾大類型 ? :除草作用的酶和蛋白質(zhì)基因 。 效率低 。隨后 TDNA攜帶的基因在植物中表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)。 ? 第二類是致瘤基因 ? 生長(zhǎng)素基因（ Aux）。 ? TDNA:農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，從 Ti質(zhì)粒上切割下來轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的一段 DNA，稱為轉(zhuǎn)移 DNA。 ? 特點(diǎn)：①由兩個(gè)質(zhì)粒（ Ti質(zhì)粒）重組而成，分子量較大； ? ②共合體的形成頻率與兩個(gè)質(zhì)粒的重組頻率有關(guān) ,相對(duì)較低； ? ③必須用 Southern雜交或 PCR對(duì)大的共整合體質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)； ? ④構(gòu)建時(shí)比較困難。 ? T區(qū)與 Ti質(zhì)粒的 TDNA十分相似： ? ① T區(qū)的左右邊界序列，含有 25bp的重復(fù)序列。該區(qū)中含有與農(nóng)桿堿合成有關(guān)的基因（ ags）和生長(zhǎng)素合成有關(guān)的基因（ tms tms2）。 ? 目前 ,用的較多的是 花椰菜花斑病病毒 (CaMV)和煙草花葉病毒 (TMV)。 ? 優(yōu)點(diǎn) ,包括可保護(hù) DNA在導(dǎo)入細(xì)胞之前免受核酸酶的降解作用 ,降低了對(duì)細(xì)胞的毒性效應(yīng) ,適用的植物種類廣泛 ,重復(fù)性高 ,包裝在脂質(zhì)體內(nèi)的DNA可穩(wěn)定地貯藏等。 ? 是繼農(nóng)桿菌介導(dǎo)法之后的第二大基因轉(zhuǎn)化法。 操作簡(jiǎn)單快速 ? 但該方法轉(zhuǎn)化率低，外源 DNA整合機(jī)理不清楚。 ? ： 植體材料經(jīng)過脫分化培養(yǎng)誘導(dǎo)形成愈傷組織，轉(zhuǎn)化（帶有目的基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染），分化培養(yǎng)獲得再生植株。 ? 一是利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行小孢子和卵細(xì)胞的單倍體培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)； ? 二是直接利用花粉和卵細(xì)胞受精過程進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，如花粉管導(dǎo)入法，花粉粒浸泡法，子房微針注射法等。 （四）表達(dá)和分析 ? 基因水平的檢測(cè)： RE分析， DNA序列分析，PCR， Southern Blot，RFLP， RAPD等。由于熒光強(qiáng)度高，本底低，故熒光檢測(cè)極為靈敏。 ? 1967年美國(guó)化學(xué)家 Wall和 Wani首先從太平洋紫 杉（短葉紅豆杉）樹皮中提取出來。 ? 紫杉醇的國(guó)際市場(chǎng)價(jià)格為450美元 /g ? B5培養(yǎng)基，補(bǔ)糖，暗培養(yǎng) ? 低濃度的生長(zhǎng)激素 ? 誘導(dǎo)子 ? 培養(yǎng)基中加甲基戊酸，苯丙氨酸等前體 ? 加甲瓦龍酸等中間產(chǎn)物 ? 加單萜合成抑制劑 ? 篩選細(xì)胞株 ? 最高產(chǎn)量達(dá) (3)丹參發(fā)根生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) ? 丹參 (Salvia miltiorrhiza) ：活血化淤 ,通經(jīng)止痛 . ? 丹參中含有二類活性成分 : 脂溶性二萜醌類化合物和水溶性酚酸類化合物 .具有抑制血小板聚集、耐缺氧、改善冠狀動(dòng)脈供血等藥理作用 ,是治療心血管系統(tǒng)疾病的重要藥物。 (4)紫草細(xì)胞培養(yǎng) ? 化學(xué)成分 :含乙酰紫草素、 β 羥基異戊酰紫草素、紫草素、β ， β ’二甲基