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正文內(nèi)容

植物細(xì)胞工程制藥(編輯修改稿)

2025-03-10 12:28 本頁(yè)面
 

【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 粒,感染 雙子葉植物 時(shí),質(zhì)粒中 DNA整合到植物的染色體上,并隨染色體一起復(fù)制。隨后 TDNA攜帶的基因在植物中表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)。 ? Ti質(zhì)粒是約 160240kb的環(huán)狀 DNA分子。 ? Ti質(zhì)粒具有兩個(gè)區(qū)域, TDNA和 毒性區(qū)域 (vir) ? 還具有冠癭堿代謝 (opine catabolism)、復(fù)制原點(diǎn) (ori) 。 ? TDNA區(qū)包括: ?章魚(yú)堿合成酶基因 nos ?植物生長(zhǎng)素生物合成酶基因 Tm1,Tm2 ?植物分裂素生物合成酶基因 tmr TDNA區(qū)編碼的基因 ? 第一類(lèi)是編碼冠癭堿合成酶及分解代謝基因 。 ? 第二類(lèi)是致瘤基因 ? 生長(zhǎng)素基因( Aux)。即腫瘤細(xì)胞莖芽產(chǎn)生 Tms基因( tumour morphology shoot) ? Auxl( Tm1),編碼色氨酸單加氧酶 ,將色氨酸轉(zhuǎn)變成吲哚乙酰胺 IAM ? Aux2 ( Tm2),編碼吲哚乙酰胺水解酶,將 IAM轉(zhuǎn)變成乙酸吲哚 IAA。 ? 細(xì)胞分裂素基因( cyt),突變將引起易生根特性。故稱(chēng)為 Tmr( tumour morphology root)基因 ? 由于 Tms和 Tmr基因的表達(dá),使轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞內(nèi)激素平衡紊亂,冠癭瘤細(xì)胞無(wú)限生長(zhǎng),形成激素自主性特性,引起癌變。 ? TDNA:農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí),從 Ti質(zhì)粒上切割下來(lái)轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的一段 DNA,稱(chēng)為轉(zhuǎn)移 DNA。該 DNA片段上的基因與腫瘤的形成有關(guān) ? 直接參與轉(zhuǎn)移并整合的,僅是 TDNA兩端與其它序列交界處的 25bp不完全直接重復(fù),為右界 (right border, RB)和左界 (left border,LB)。 TDNA區(qū)域內(nèi)的所有基因與轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān),將致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后,將其它序列插入到這個(gè)區(qū)域,形成的TDNA仍可將 RB至 LB內(nèi)的序列轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組。 ? Vir基因 :區(qū)段上的基因能激活 TDNA轉(zhuǎn)移,使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性 根據(jù)其誘導(dǎo)的植物冠癭瘤中所合成的冠癭堿種類(lèi)不同, Ti質(zhì)??梢员环殖伤姆N類(lèi)型: ? 章魚(yú)堿型 (octopine) ? 胭脂堿型 (nopaline) ? 農(nóng)桿堿型( agropine) ? 農(nóng)桿菌素堿型( agrocinopine)或稱(chēng)琥珀堿型(succinamopine) ? 為了使 Ti質(zhì)粒成為有效的外源基因?qū)胼d體,必須對(duì)野生型 Ti質(zhì)粒進(jìn)行改造 ? 去除致瘤基因,及冠癭堿合成基因,保留左右邊界,及毒性區(qū)域 ? 增加選擇標(biāo)記(如:大觀霉素)和報(bào)告基因 ? 增加大腸桿菌復(fù)制起始子,構(gòu)建植物細(xì)胞 大腸桿菌穿梭質(zhì)粒 ? 目前有 共整合載體系統(tǒng) 和 雙元載體系統(tǒng) ? 共整合載體 :載體的 TDNA區(qū)與 Ti質(zhì)粒 Vir區(qū)連鎖 ,又稱(chēng)之為順式載體 ( cisvector) 。 ? 特點(diǎn):①由兩個(gè)質(zhì)粒( Ti質(zhì)粒)重組而成,分子量較大; ? ②共合體的形成頻率與兩個(gè)質(zhì)粒的重組頻率有關(guān) ,相對(duì)較低; ? ③必須用 Southern雜交或 PCR對(duì)大的共整合體質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè); ? ④構(gòu)建時(shí)比較困難。 共整合載體和農(nóng)桿菌 質(zhì)粒重組過(guò)程 土壤農(nóng)桿菌 植物 DNA轉(zhuǎn)移體系步驟 ? 植物敏感細(xì)胞和土壤農(nóng)桿菌相互作用 ? 土壤農(nóng)桿菌的毒性區(qū)基因被激活 ? TDNA的切割和 T復(fù)合物生成 ? T復(fù)合物由土壤農(nóng)桿菌經(jīng)植物細(xì)胞膜進(jìn)入植物細(xì)胞 ? TDNA整合到植物染色體上 ? 雙元載體系統(tǒng) :由兩個(gè)分別含 TDNA和 Vir區(qū)的相容性突變 Ti質(zhì)粒構(gòu)成的雙質(zhì)粒系統(tǒng) ,又因?yàn)槠?TDNA與 Vir基因在兩個(gè)獨(dú)立的質(zhì)粒上,通過(guò)反式激活 TDNA轉(zhuǎn)移 ,故稱(chēng)之為反式載體( trans vecter) . ? 包括兩個(gè) Ti質(zhì)粒,即微型 Ti質(zhì)粒和輔助 Ti質(zhì)粒。 ( 2)發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化 ? Ri質(zhì)粒為根誘導(dǎo)質(zhì)粒。 ? Ri質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與 Ti質(zhì)粒很相似,分為 T區(qū)、 vir區(qū)、 ori區(qū)等。 ? T區(qū)與 Ti質(zhì)粒的 TDNA十分相似: ? ① T區(qū)的左右邊界序列,含有 25bp的重復(fù)序列。 ? ② TLDNA區(qū)。該區(qū)中含有與毛狀根形成有關(guān)的 rolA、 B、 C、D基因群。 ? ③ TRDNA區(qū)。該區(qū)中含有與農(nóng)桿堿合成有關(guān)的基因( ags)和生長(zhǎng)素合成有關(guān)的基因( tms tms2)。 ags基因在轉(zhuǎn)化的初期起著重要的作用,是不定根產(chǎn)生的關(guān)鍵 和 Ti質(zhì)粒相比, Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化有許多優(yōu)點(diǎn): ? ① Ri質(zhì)??梢圆唤?jīng) “ 解除武裝 ” 進(jìn)行轉(zhuǎn)化,并且轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的發(fā)根能夠再生植株; ? ②發(fā)狀根是一個(gè)單細(xì)胞克隆,可以避免嵌合體; ? ③ Ri質(zhì)粒和 Ti質(zhì)??梢耘浜鲜褂茫㈦p元載體系統(tǒng),拓展了兩種質(zhì)粒應(yīng)用范圍; ? ④發(fā)根適用于進(jìn)行離體培養(yǎng),很多植物的發(fā)根在離體培養(yǎng)條件下都有原植物次生代謝產(chǎn)物合成能力。 (3)植物病毒載體 ? 病毒載體只要與植物細(xì)胞共培養(yǎng)就可以較高地感染植物細(xì)胞;且外源基因能在植物細(xì)胞中快速?gòu)?fù)制和高水平表達(dá)。 ? 但病毒載體的容量有限 ,不能包裝大片段 ,寄主范圍窄 ,復(fù)制穩(wěn)定性差 ,轉(zhuǎn)錄和復(fù)制機(jī)理復(fù)雜。 ? 目前 ,用的較多的是 花椰菜花斑病病毒 (CaMV)和煙草花葉病毒 (TMV)。 ? 需要注意的是其他病毒侵染植株后可能會(huì)跟所用的載體病毒之間發(fā)生信息交換 ,進(jìn)而導(dǎo)致載體病毒重新獲得其致病能力 Promoters used for expression in transgenic plants 35S, cauliflower mosaic virus 35S promoter CaMV 35S is a strong promoter that is active in essentially all dicot plant tissues. CaMV is a circular dsDNA genome virus ? 農(nóng)桿菌載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)對(duì)單子葉植物的局限性 ? ( 1) DNA直接吸收到植物細(xì)胞 制備原生質(zhì)體, 電穿孔法 PEG等介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化 ( 2)顯微注射法 ? 顯微注射,是利用顯微注射儀將外源 DNA直接注入受體細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中。顯微注射的一個(gè)重要問(wèn)題是必須把受體細(xì)胞進(jìn)行固定。 ? 不需要去除細(xì)胞壁 ? 成本高 ? 細(xì)胞存活率低 ( 3)脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化 ? 脂質(zhì)體法是用脂類(lèi)化學(xué)包裹 DNA成球體,通過(guò)植物原生質(zhì)體的吞噬或融合作用把內(nèi)含物轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。 ? 優(yōu)點(diǎn) ,包括可保護(hù) DNA在導(dǎo)入細(xì)胞之前免受核酸酶的降解作用 ,降低了對(duì)細(xì)胞的毒性效應(yīng)
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