細胞工程第五章ppt課件(編輯修改稿)
2024-10-08 20:17 本頁面
【文章內容簡介】 裝：混合細胞中加入 HAT培養(yǎng)液 ， 濃度為 ２ 105細胞 / ， ５ ~6天出現(xiàn)新細胞克隆 。 將不完全培養(yǎng)基加入融合細胞的過程要小心謹慎。細胞在 離心和高濃度 PEG作用下 皺縮 并呈現(xiàn) 交融 狀態(tài)，加入不完全培養(yǎng)基時大量水分涌入使細胞很快 膨脹 ，若加入液體過快過多，細胞可能會因此崩解 而導致 融合失敗 。 骨髓瘤細胞 淋巴細胞 沒融合的淋巴細胞 610天死亡 雜交瘤細胞 沒融合的骨髓細胞 如何選擇？ (三）融合細胞的篩選 HAT培養(yǎng)基篩選 DNA 內源性途徑 (主要途徑 ) 谷氨酰胺 二氫葉酸還原酶 A H T 外源性途徑 (旁路途徑 ) (Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase) 次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶 ( HGPRT ) 胸腺嘧啶激酶 ( TK ) (Thymidine kinase) B淋巴細胞 ： HGPRT+， TK+ 骨髓瘤細胞 ： HGPRT， TK 存活 死亡 外源性途徑 (旁路途徑 ) H, 次黃嘌呤 。 A, 氨基喋呤 。 T, 胸腺嘧啶 融合細胞： 具有親代雙方的遺傳性能，具有 來自于淋巴細胞內的 HGPRT與 TK ，因此 可利用培養(yǎng)基中的嘌呤與嘧啶采用 補救途徑合成 DNA， 因此可在HAT培養(yǎng)基中 存活與繁殖 。 （四） 分泌抗體的融合細胞的篩選 —— ELISA方法檢測抗體 ? 雜交瘤抗體檢測 ? 抗原結合法 ? 第二抗體法 ELISA法檢測單克隆雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清 ，選出分泌特異性抗體的陽性孔 ， 所分泌抗體即為 單克隆抗體 。 酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA) 抗原 第 1抗體 酶 第 2抗體 待檢雜交瘤培養(yǎng)上清液 底物 有色產物 酶標儀檢測 抗原抗體復合物 產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，根據(jù)顏色反應的深淺進行定性或定量分析。 （五） 雜交瘤細胞克隆化培養(yǎng) 一旦檢測到分泌目標抗體的克隆，應及時將陽性克隆轉入培養(yǎng)瓶擴大培養(yǎng)并盡快進行克隆化培養(yǎng)。目的是利用單個細胞克隆化培養(yǎng)從細胞群體中選育出 遺傳穩(wěn)定的能分泌特異性抗體的雜交瘤細胞 ，淘汰非特異性的或遺傳不穩(wěn)定的雜交瘤細胞。 及早進行，以免無關克隆 過度生長。 常用克隆化方法： 有限稀釋法 軟瓊脂平板法 顯微操作法 通常用“ 有限稀釋法 ”來選擇： 將雜交瘤細胞稀釋，用 多孔細胞培養(yǎng)板 培養(yǎng)，使每孔細胞不超過一個，通過培養(yǎng)讓其增殖。然后 檢測各孔上清液中細胞分泌的抗體 （常用酶聯(lián)免疫吸附試驗法），那些上清液可與特定抗原結合的培養(yǎng)孔為陽性孔。 陽性孔中的細胞還不能保證是來自單個細胞，挑選陽性孔的細胞繼續(xù)進行有限稀釋，一般需進行 3～ 5次，直至得到基因型和表型穩(wěn)定的單克隆細胞株。 單細胞克隆培養(yǎng)時細胞處于不利于生長的環(huán)境（大量非融合細胞或同核體融合細胞死亡），在培養(yǎng)孔中加入 飼養(yǎng)層細胞 可提高克隆效率。 飼養(yǎng)層細胞（ feeder cell）可釋放某些 生長刺激因子 到培養(yǎng)液中，促進了雜交瘤 細胞生長 ，并能 滿足雜交瘤對生長密度的需要 ，從而提高雜交瘤細胞存活率。 小鼠腹腔巨噬細胞、小鼠胸腺細胞、小鼠脾細胞等。 問題：整個制備過程為何要經過 兩次篩選 ? 第一次篩選：用特定的選擇培養(yǎng)基篩選出多種雜交瘤細胞，但 這些雜交瘤細胞并非都是能分泌所需抗體的細胞。 第二次篩選（ 克隆化培養(yǎng)和抗體檢測 ）：篩選出能產生所需抗體的雜交瘤細胞。 （六）大規(guī)模培養(yǎng) —— 批量生產單克隆抗體 常用的大規(guī)模培養(yǎng)方法： ◆ 動物接種法 ◆ 轉瓶培養(yǎng)法 ◆ 細胞培養(yǎng)罐法 培養(yǎng)上清中 X抗體的檢測 克隆化培養(yǎng) 單克隆雜交瘤細胞培養(yǎng)上清中 X抗體的檢測 雜交瘤細胞可持續(xù)分泌單克隆抗體 規(guī)模化培養(yǎng) 獲得大量單克隆抗體 動物免疫 細胞融合 混合細胞的 HAT篩選 ) 分泌 X抗體 B淋巴細胞 骨髓瘤細胞 X抗原 B淋巴細胞 瘤的突變株 培養(yǎng)數(shù)天后細胞死亡 無限生長細胞 分泌 X抗體 只有雜交瘤細胞可長期存活下來 BALB/c 雜交瘤技術操作流程圖解 抗體的檢測單克隆雜交瘤細胞培養(yǎng)上清中 抗體的檢測雜交瘤細胞可持續(xù)分泌單克隆抗體獲得大量單克隆抗體篩選培養(yǎng)數(shù)天后細胞死亡只有雜交瘤細胞可長期存活下來四、單克隆抗體的應用 與常規(guī)抗體相比，單克隆抗體 產量高，特異性強，靈敏度高 ，優(yōu)越性十分明顯 。 提高免疫分析或其他新分析的靈敏度和重復性 。 臨床診斷： 準確 、 高效 、 簡易 、 快速 性傳播疾病 、 血型 、 懷孕或排卵 、 癌 （ 早期癌抗原的檢測 ） 作為載體 ， 運載抗癌藥物 ， 形成 “ 生物導彈 ”治療腫瘤 。 小 結 ? 細胞融合的定義、原理與方法 ? 融合細胞的篩選方法：雜交瘤細胞的篩選方法 ? 單克隆抗體的制備流程 單克隆抗體制備視頻： 課堂測驗（三） 鼠源性單克隆抗體仍帶有 鼠抗原決定簇 而使其應用具有局限性。例如注射到人體內引起 人抗鼠反應 、 過敏反應 、抗體很快 被清除 、 不能有效激發(fā)免疫防御 系統(tǒng)等問題。 現(xiàn)在的目標是獲得低免疫原性、高效性的 人源化單克隆抗體 。 課后問題：查閱文獻論述人源化單克隆抗體的研究進展。 知識回顧 培養(yǎng)上清中 X抗體的檢測 克隆化培養(yǎng) 單克隆雜交瘤細胞培養(yǎng)上清中 X抗體的檢測 雜交瘤細胞可持續(xù)分泌單克隆抗體
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