【正文】 后面的離子稱慢離子，又稱尾隨離子(trailing ion)。為了使樣品達(dá)到濃縮的目的，需在電泳緩沖系統(tǒng)中加入有效遷移率大小不同的兩種離子，并使這兩種離子在緩沖系統(tǒng)中組成不連續(xù)的兩相，即在三層凝膠中加入快離子，在電極緩沖液中加入慢離子。 為了保持溶液的電中性及一定的PH值，需加入一種與快、慢離子符號相反的離子，稱為緩沖配對離子(buffer counter ion)，使緩沖配對離子分布于全部電泳緩沖系統(tǒng)中(即三層凝膠及電極緩沖液中)。例如，分離蛋白質(zhì)樣品時(shí)，通常用氯根(Cl)為快離子，甘氨酸根負(fù)離子(NH2CH2COO)為慢離子，三羥甲基氨基甲烷(Tris+)作為緩沖配對離子。電泳開始前(圖6A) 慢離子位于兩個(gè)電極槽中，快離子分布在三層凝膠中，樣品在樣品膠中，緩沖配對離子位于全部系統(tǒng)中。電泳進(jìn)行中(圖 6B) 快離子與慢離子的界面向下移動。由于選擇適當(dāng)?shù)腜H值緩沖液，使蛋白質(zhì)樣品的有效遷移率介于快、慢離子的界面處，而濃縮成為極窄的區(qū)帶。它們的有效遷移率，按下列次序排列，mclαcl＞ m pαp＞ m GαG。樣品若是有顏色的，可以看到樣品在界面處堆積濃縮成極窄的區(qū)帶。樣品分離(圖6C) 當(dāng)樣品達(dá)到濃凝膠與分離界面處，離子界面繼續(xù)前進(jìn)，蛋白質(zhì)被留在后面，然后分成多個(gè)區(qū)帶。 C、電位梯度的不連續(xù)性電位梯度的高低與電泳速度的快慢有關(guān)，因?yàn)殡娪舅俣鹊扔陔娢惶荻扰c遷移率的乘積，遷移率低的離子，在高電位梯度中可以與具有高遷移率而處于低電位梯度的離子具有相似的速度。 在高電位梯度區(qū)和低電位梯度區(qū)之間的地方形成一個(gè)迅速移動的界面(圖7)，由于蛋白質(zhì)樣品的有效遷移率恰好介于快慢離子之間，因此也就聚焦在這個(gè)移動的界面附近，被濃縮形成一個(gè)狹小的中間層。 D、pH的不連續(xù)性在濃縮膠與分離膠之間有pH的不連續(xù)性，這是為了控制慢離子的解離度，從而控制其有效遷移率，要求在樣品膠和濃縮膠中，慢離子較所有被分離樣品的有效遷移率低，以使樣品夾在快、慢離子界面之間，使樣品濃縮。而在分離膠中慢離子的有效遷移率比所有樣品的有效遷移率高，使樣品不再受離子界面的影響。② 凝膠的分子篩效應(yīng)；分子量或分子大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑的分離膠時(shí)，受阻滯的程度不同，因此表現(xiàn)出不同的遷移率，即所謂分子篩效應(yīng)，即使凈電荷相似，也就是說自由遷移率相等的蛋白質(zhì)分子，也會由于分子篩效應(yīng)在分離膠中被分開。此處分子篩效應(yīng)是指樣品通過一定孔徑的凝膠時(shí)，小分子走在前面，大分子走在后面與凝膠層析的分子篩效應(yīng)相反。③ 一般電泳分離的電荷效應(yīng)。蛋白質(zhì)混合物在膠界面處被高度濃縮，堆積成層，形成一狹小的高濃度的蛋白質(zhì)區(qū)，但由于每種蛋白質(zhì)分子所載有效電荷不同，因而遷移率不同。承載有效電荷多的，泳動得快，反之則慢，因此各種蛋白質(zhì)就以一定的順序排列成一個(gè)一個(gè)的圓盤狀。在進(jìn)入分離膠時(shí)，此種電荷效應(yīng)仍起主要作用。 樣品的濃縮效應(yīng)是在濃縮膠中進(jìn)行的，電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)主要是在分離膠中進(jìn)行的。在蛋白質(zhì)樣品進(jìn)入分離膠時(shí)，由于在濃縮膠中的慢離子跑到蛋白質(zhì)前面去，高電勢梯度消失，使蛋白質(zhì)進(jìn)入到均一電勢梯度和pH的分離膠中。此時(shí)，又由于分離膠的孔徑小，各蛋白質(zhì)因分子大小和形狀不一樣而被這孔徑阻滯的程度也不相同，使一些即使是凈電荷相同的蛋白質(zhì)分子也因分子篩效應(yīng)不同而得到分離。由于這三種物理效應(yīng)，使樣品分離效果好，分辨率高。 不連續(xù)電泳的壓縮成層效應(yīng)：上面加稀濃度孔徑大的濃縮膠用以濃縮樣品，下面加濃度高的分離膠，其孔徑小，起分子篩的作用。 其中，bisN，N’甲叉雙丙烯酰胺 作為膠粘劑，促丙烯酰胺聚合原理： Tris甘氨酸緩沖液等電點(diǎn)6左右,(HCl完全電離).樣品膠中加入trisHCl系統(tǒng)， HCl完全解離， tris ~1%， Cl離子遷移最快，有效泳動率（泳動率 X 解離度）： Cl離子樣品 ,Cl離子在樣品前，樣品后形成濃度低的電導(dǎo)區(qū)，在低電導(dǎo)區(qū)產(chǎn)生較高的電勢梯度，推動樣品和tris快速運(yùn)動，樣品介于快、慢離子間，從而形成壓縮移動界面，進(jìn)入分離膠后，按各自分子的大小和電荷的不同而分離（大分子在前）。（2）聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作方法(A)安裝夾心式垂直板電泳槽(B)制備凝膠板(C)加樣(D)電泳(E)卸板(F)固定、染色(G)脫色(H)記錄A、器材v 電泳儀：電壓在0～600v內(nèi)任意調(diào)節(jié)，電流輸出0～100mA，這類電泳儀比較恰當(dāng)。v 夾心式垂直板電泳槽，v 微量注射器或微量進(jìn)樣器：加樣時(shí)，由于需樣品量極小，作定量分析時(shí)要求樣品量準(zhǔn)確，也可用50或100μl加液器代用。B、試劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis)；丙烯酰胺(Acr)；四甲基乙二胺(TEMED)；過硫酸銨；核黃素(VB2)；三羥甲基氨基甲烷(Tris)；蔗糖；甘氨酸；鹽酸等。丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺產(chǎn)品不純時(shí)需要純化后才能使用。(a)丙烯酰胺純化法：70g丙烯酰胺溶于500ml氯仿中(50℃)，熱濾，濾液涼后置20℃冰箱，即有結(jié)晶析出，砂芯漏斗過濾，收集結(jié)晶。結(jié)晶置于真空干燥器中減壓干燥，貯棕色瓶中備用。(b)甲叉雙丙烯酰胺純化法：12g甲叉雙丙烯酰胺溶于100ml 40～50℃丙酮，加熱過濾，濾液置20℃冰箱，結(jié)晶析出后過濾，并置于真空干燥器中干燥，保存于棕色瓶中備用。C、操作技術(shù)(A)安裝夾心式垂直板電泳槽 夾心式垂直板電泳槽(圖11)兩側(cè)為有機(jī)玻璃制成的電極槽，兩電極槽中間有一凝膠模(圖12)，該模由ㄩ形硅膠框，長、短玻璃板，模板梳組成，電泳槽由上貯槽(白金電極面對短玻璃板)，下貯槽(白金電極面對長玻璃板)和回紋冷凝管組成，兩電極槽與凝膠模間靠貯液槽螺絲固定，其組裝順序?yàn)椋孩傺b貯槽和固定螺絲銷釘；②將洗凈的長、短玻璃板分別插到ㄩ形硅橡膠框的凹形槽中，注意不要用手接觸灌膠面的玻璃；③將已插好玻板的凝膠模夾到貯槽中，短玻璃板應(yīng)面對上貯槽，長玻璃板應(yīng)面對下貯槽，雙手以對角線的方式旋緊螺絲帽；④豎直電泳槽，用滴管吸取少量的1%瓊脂糖溶液，灌入凝膠模板底部(長玻璃板外側(cè)，下沿凹形小槽內(nèi))，～,待瓊脂糖凝固后,即堵住凝膠模下面的窄縫(通電時(shí)又可作為鹽橋)。(B)制備凝膠板①分離膠制備：配制分離膠溶液，將凝膠溶液沿玻棒小心注入到長、短玻璃板間的狹縫內(nèi)(膠高度距樣品模板梳齒下緣約1cm)，用注射器在凝膠表面沿短玻板邊緣輕輕加一層水以隔絕空氣，并使膠面平整。為防止?jié)B漏，在上下貯槽中加入略低于膠面的蒸餾水。約30～60分鐘凝膠完全聚合后，可看到水與凝固的膠面有折射率不同的界限，用濾紙吸去多余的水。②濃縮膠制備：配制濃縮膠溶液，用滴管將凝膠溶液注入到長、短玻璃板間的狹縫內(nèi)(分離膠上方)，輕輕加入樣品模板梳，用日光燈照射進(jìn)行光聚合，約30分鐘后，凝膠由淡黃透明變成乳白色，聚合完全后，輕輕取出樣品模板梳，加入電極緩沖液。(C)加樣 用微量注射器取樣品溶液5～10μl，小心地加入到凝膠凹形樣品槽底部，因樣品比重大于電極緩沖液，因此樣品液自動沉降在膠面上平鋪成一層。(D)電泳 加樣畢，%溴酚藍(lán)數(shù)滴，不要移動電泳槽(防引起樣品漂流)，接通電源，先低壓電泳一般時(shí)間，待指示劑在膠板上成一條直線時(shí)，即可將電泳槽移入冰箱，按所需電流電壓進(jìn)行電泳。溫度控制在0～4℃。由于電流和電壓同電極緩沖液的離子強(qiáng)度有關(guān)，因此根據(jù)電極緩沖液分高離子強(qiáng)度和低離子強(qiáng)度兩種。高離子強(qiáng)度電極緩沖液配方： Tris加水1000ml，；低離子強(qiáng)度電極緩沖液配方： Tris加水至1000ml，用時(shí)衡釋10倍。當(dāng)電極緩沖液離子強(qiáng)度確定后，又有穩(wěn)定電流和穩(wěn)定電壓兩種電泳方式。用高離子強(qiáng)度電泳液，～，電泳16小時(shí)左右；用低離子強(qiáng)度電泳液，～，電泳16小時(shí)左右，此為穩(wěn)定電流的方法。穩(wěn)定電壓電泳方式通常是這樣：用高離子強(qiáng)度時(shí)，穩(wěn)定電壓10V/cm，電泳14～15小時(shí)；用低離子強(qiáng)度時(shí)，穩(wěn)定電壓20V/cm，約4～5小時(shí)。若指示劑移動到離下層電泳液水平面1cm處，即可關(guān)閉電源，停止電泳。(E)卸板 電泳完畢，從冰箱中取出電泳槽，吸出電極緩沖液，將膠板從電泳槽上卸下，平放在實(shí)驗(yàn)臺上，用壓舌板在兩塊玻璃板的一角輕輕一撬，揭去上面長型玻璃板。用刀片在膠板一端切除一角作為標(biāo)記，而后用磨平針尖的獸醫(yī)用針頭吸取無離子水把凝膠從短型玻璃板上剝離，慢慢地把膠板沖入白瓷盤或大培養(yǎng)皿內(nèi)，即可染色與固定。(F)固定與染色為防止凝膠柱內(nèi)已分離成分的擴(kuò)散，需要進(jìn)行固定。剝出的凝膠柱只要浸泡在7%%三氯乙酸的水溶液中幾分鐘就可達(dá)到蛋白帶固定的效果。也可浸泡在用7%%三氯乙酸配制的染色液中，同時(shí)進(jìn)行固定和染色。如果用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離和鑒定同工酶，為了讓酶帶上進(jìn)行某種顯色反應(yīng)，往往是先顯色后固定。用于蛋白質(zhì)區(qū)帶染色的試劑常用的有氨基黑10B、考馬斯亮藍(lán)，1苯胺基8萘磺酸等， 【蛋白質(zhì)的常用染色法】(G)脫色凝膠柱染色后，先用水洗掉表面染料，然后放在脫色液中浸洗，常用的脫色液有7%乙酸，甲醇水乙酸溶液等。經(jīng)常更換新溶液，直到染料洗出，背景幾乎無色為止。用氨基黑染色的，脫色時(shí)間較長，而考馬斯亮藍(lán)染料易于脫色。為了短時(shí)間得出結(jié)果，可采用電泳脫色。即在一玻璃或有機(jī)玻璃槽中盛7%的乙酸溶液，已染色的膠放置在槽中間，兩邊加鉑金電極，并通直流電，電壓30～40V，1～2小時(shí)即可脫色完畢。(H)結(jié)果和記錄 ① 繪制示意圖② 測量相對遷移率(Rf) ③ 照相 ④ 光密度計(jì)掃描定量 可以制成干板保存。在水中用兩張比膠板稍大的玻璃紙，將膠板夾在中間，平放在玻璃板上，排除氣泡，四周用玻璃條壓住并用夾子固定在玻璃板上，30℃烘干或自然風(fēng)干。包前如將膠板放在10%的甘油中浸泡片刻，則效果會更好。等電聚焦電泳（高分辨率）等電聚焦(isoelectric focusing)，縮寫為IEF或EF，也稱等電分離、等電點(diǎn)劃分，等電點(diǎn)分析、聚焦電泳等，是六十年代后期才發(fā)展起來的新技術(shù)，它不僅用來分離、鑒定和測定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，分離復(fù)合蛋白，同時(shí)還可以結(jié)合SDS電泳，密度梯度和一般凝膠電泳進(jìn)行雙向電泳來分析蛋白質(zhì)的亞基，分子大小和各種蛋白質(zhì)成分的圖譜，因此，它已成為電泳中不可缺少的技術(shù)。依據(jù)蛋白質(zhì)為典型的兩性電解質(zhì)，且各種蛋白質(zhì)帶有各自不同的帶電基團(tuán)，將蛋白質(zhì)混合物加入已平衡的pH梯度中，它們在電場作用下無論其原始分布如何，最終將移動到與其等電點(diǎn)相同的載體兩性電解質(zhì)所在位置上，形成不同的蛋白質(zhì)區(qū)帶，從而達(dá)到蛋白質(zhì)分離的效果。優(yōu)點(diǎn)：點(diǎn)樣時(shí)無須點(diǎn)在電泳槽中、位置不受限制，分辨率高，操作方便，分離時(shí)間短，適于蛋白質(zhì)的微量分析載體：兩性電解質(zhì)，~，由羧酸與聚乙烯多胺在特殊條件下合成的無數(shù)種化合物的混合物，每種都有其特定的、略有不同的pI值。良好的載體兩性電解質(zhì)具備條件：1）等電點(diǎn)附近有高度緩沖能力，即使在高濃度的蛋白質(zhì)存在下也有控制pH梯度（穩(wěn)定）的性質(zhì)；2）有適宜的電導(dǎo)使電泳凝膠中有比較均勻的電勢降以免聚焦過程中局部過熱而使蛋白質(zhì)變性；3）分子量適度，3001000，低于300緩沖能力變小，高于1000與被分離的高分子物質(zhì)難以分開；4）在280nm的吸收值要低，不干擾蛋白質(zhì)測定；5）不與被分離的物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，不與金屬離子螯合（免使以金屬離子為活性中心的酶失活）；6）無毒、不致癌。目前常用的載體兩性電解質(zhì)商品有ampholine(LKB公司)、Pharmlyte(Pharmacia)、Serralyte(Serva)以及國產(chǎn)的Ampholine(上海生化所東風(fēng)廠生產(chǎn))。 Ampholine是具有多等電點(diǎn)的多氨基多羧基酸類化合物，其主要理化性質(zhì)為：① Ampholine是具有多等電點(diǎn)的多氨基多羧基酸類化合物，其主要理化性質(zhì)為：② 緩沖性能強(qiáng) Ampholine溶液在一定PH范圍內(nèi)有充分的緩沖能力，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)進(jìn)入與其等電點(diǎn)相應(yīng)的PH區(qū)域時(shí)，PH值并無變化；③ 導(dǎo)電性能好 Ampholine溶液有均衡的電場強(qiáng)度，但是在PH等于中性的區(qū)域?qū)щ娦阅茌^差。因此在應(yīng)用時(shí)，不管選擇什么PH范圍，一般都要加入其總量1/10的PH6～8的Ampholine溶液，以保持電場強(qiáng)度的均勻性；④ 分子量小 Ampholine一般分子量都在300～1000之間。一便用分子篩或透析等方法將它與被分離的高分子物質(zhì)分開；⑤ 紫外吸收值低 Ampholine對于在280nm處測定蛋白質(zhì)吸收值的干擾小，但是如果蛋白質(zhì)濃度低，Ampholine用量又高，則往往干擾較明顯，嚴(yán)重時(shí)應(yīng)進(jìn)行矯正；⑥ 一般與樣品不起化學(xué)反應(yīng)。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù) SDS(sodium dodecyl sulfate)，H25C12NaSO4 M＝，是一種很強(qiáng)的陰離子表面活性劑。SDS能破壞蛋白質(zhì)分子間的結(jié)構(gòu)(尤其是在強(qiáng)還原劑如巰基乙醇存在下，使蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵還原打開)，并以其疏水基和蛋白質(zhì)分子的疏水區(qū)相結(jié)合，形成牢固的帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物。在一定條件下。所引入的凈電荷大約為蛋白質(zhì)本身的凈電荷的10倍，使得其所帶電荷遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)原有的凈電荷，從而清除或大大降低了不同蛋白質(zhì)之間所帶的凈電荷不同對電泳遷移率的影響。SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還引起了蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變，測定時(shí)，通常選用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)作為“標(biāo)記物”(maker)，與分子量未知的待測蛋白質(zhì)樣品在同一條件下進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對遷移率，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上與分子量的對數(shù)作圖，可得到一條lgMWmR的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出待測蛋白質(zhì)樣品的mR所對應(yīng)的lgMW，即可求得分子量。用SDS凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)分子量時(shí)，應(yīng)注意以下幾個(gè)問題： v SDS/1g, 蛋白質(zhì)的比率并具有相同的構(gòu)象，就不能得到準(zhǔn)確的結(jié)果。 v 不同的凝膠濃度適用于不同的分子范圍 v 有許多蛋白質(zhì)，是由亞基或兩條以上肽鏈組成的，它們在SDS和巰基乙醇的作用下，解離成亞基或單條肽鏈。因此，對于這一類蛋白質(zhì)，SDS凝膠電泳測定的只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量，而不是完整分子的分子量。為了得到更全面的資料，還必須用其他方法測定其分子量及分子中肽鏈的數(shù)目等，與SDS凝膠電泳的結(jié)果相互參照