【正文】 ：一般用 2）針：穿刺用 3）扒、鏟： 用于真菌（長在培養(yǎng)基內(nèi)）4）鉤： 用于放線菌（未長孢子，菌絲在培養(yǎng)基內(nèi)）超凈工作臺第二節(jié) 微生物采集和分純技術要點：l 不同生態(tài)條件下的微生物采集，l 加富培養(yǎng)，l 單孢分離，l 菌種復壯。正交試驗設計——減少試驗次數(shù)，確定培養(yǎng)基組分和濃度方差分析——了解哪些因素影響大，以引起注意 培養(yǎng)基的配制原則① 必須提供合成微生物細胞和發(fā)酵產(chǎn)物的基本成分；② 有利于減少培養(yǎng)基原料的單耗，單位營養(yǎng)物資所合成產(chǎn)物數(shù)量大或產(chǎn)率大；③ 有利于提高培養(yǎng)基產(chǎn)物的濃度，以提高單位容積發(fā)酵罐的生產(chǎn)能力；④ 有利于提高產(chǎn)物的合成速度，縮短發(fā)酵周期；⑤ 盡量減少副產(chǎn)物的形成；⑥ 減少對發(fā)酵過程中通氣攪拌的影響，有利于提高氧的利用率、降低能耗；⑦ 有利于產(chǎn)品的分離和純化；盡可能減少產(chǎn)生“三廢”的物質(zhì)。I. 靜置培養(yǎng)為了通氣良好，多采用淺層培養(yǎng)，以增進液體和空氣的接觸面積，有利于氧氣在水中的溶解和擴散。當好氣培養(yǎng)時，必須連續(xù)通入經(jīng)過凈化的無菌空氣，以確保培養(yǎng)液中有足夠的溶解氧。只有在沒有游離氧存在的條件下才能生長繁殖，在有氧的條件下，很難生長，甚至死亡。原理（玻璃柱內(nèi)裝有密集銅絲，加溫至350℃時，可使通過柱體的不純氮中的O2與銅反應而被除去）利用除氧銅柱來制備高純氮，再用此高純氮去驅(qū)除培養(yǎng)基配制、分裝過程中各種容器和小環(huán)境中的空氣，使培養(yǎng)基的配制、分裝、滅菌和貯存，以及菌種的接種、稀釋、培養(yǎng)、觀察、分離、移種和保藏等操作的全過程始終處于高度無氧條件下，從而保證了各類嚴格厭氧菌的存活。 外界物件進出箱體可通過有密閉和抽氣換氣裝置的交換室（由計算機自控）進行。（二）菌種保藏的基本原理及技術原理① 微生物菌種保藏的基本原理使微生物的生命活動處于半永久性的休眠狀態(tài)，也就是使微生物的新陳代謝作用限制在最低的范圍內(nèi)。把菌種接種到所需要的斜面培養(yǎng)基上，置最適溫度下培養(yǎng)到出現(xiàn)豐滿的菌體細胞或孢子后，放置于冰箱4—5℃保存，2—3個月轉(zhuǎn)接一次，傳代保藏。d) 保存效果好，保藏期限2－10年不等。濕法接種——加35ml無菌水于菌種斜面培養(yǎng)物中，制成均勻的菌懸液，用無菌吸管吸取菌懸液加到砂土管中，每管約10滴，以管內(nèi)的沙全部濕潤為宜。液氮超低溫保藏程序容器的選擇：使用帶螺旋蓋的2ml塑料安培瓶。若不用細胞懸液，則以最終所需濃度的水溶液保存。以每分鐘1℃降溫至40℃，然后以每分鐘10℃降溫至90℃。b) 顆粒的沉降速度取決于離心機的轉(zhuǎn)速及其自身與中心軸距離。③ 進一步用高速離心上清液，得到主要由中等大小顆粒組成的第二種沉淀。將樣品與適當?shù)慕橘|(zhì)混合后離心——各種顆粒在與其等密度的介質(zhì)帶處形成沉降區(qū)帶。差速離心：高低速離心交替進行，用于沉降速度差別大的物質(zhì)密度梯度離心：適用于沉降粒子差別小的情況（形成密度梯度的介質(zhì)：蔗糖、甘油）平衡等密度梯度離心： 用氯化銫與樣品混合均勻，離心時氯化銫自行形成密度梯度（氯化銫濃度在備份物質(zhì)的密度范圍之內(nèi)）差速離心舉例167。尤其用于從液體介質(zhì)如硅酮油中快速分離細胞。（5）超速離心機這是一類速度非常高的離心機，最大轉(zhuǎn)速超過了30 000 r/min，最大RCF可達到600 000 g。b. 角式轉(zhuǎn)子：許多高速離心機及微量離心機安裝。 平衡轉(zhuǎn)子——為確保離心機的安全運轉(zhuǎn)，使用時必須平衡轉(zhuǎn)子，否則轉(zhuǎn)軸及轉(zhuǎn)子組件可能會損壞；嚴重時轉(zhuǎn)子可能會停轉(zhuǎn)，造成事故。注意在有些應用中（如高速離心）離心管必須裝滿。詳細信息可參考廠家的說明書。若你想用刺穿管壁的方法收集樣品，纖維素乙酸管和聚丙烯管易于用注射管針頭刺穿。167。 怎樣使用低速臺式離心機？① 根據(jù)需要選擇大小、材料合適的離心管，必要時給離心管加上管帽。對于加在一次性塑料管內(nèi)的小體積樣品（小于10 mL）而言，精確量取液體用于低速離心就足夠了。不要超過所用轉(zhuǎn)子和離心管所能承受的最大限度。電場強度E對泳動速度起著十分重要的作用，電場強度越大，電泳速度越快，單位時間內(nèi)顆粒遷移的距離就越大，電泳時間就可縮短。a）成分q 通常電泳用的緩沖液有： 巴比妥(鈉)；硼酸(鈉)；磷酸鹽；Tris等。c）pH溶液的pH值決定了帶電顆粒解離的程度，決定了物質(zhì)所帶電荷的性質(zhì)和數(shù)量，也決定了樣品的遷移方向。 ③ 分子篩是凝膠電泳的一個特性，用來作電泳的凝膠通常具有網(wǎng)狀結構且具有彈性的半固體物質(zhì)，具有分子篩作用，使小顆粒易透過，而大顆粒不易通過，凝膠的分子篩效應對分離樣品是有利的。2) 移界電泳 它只能起到部分分離的作用，如將濃度對距離作圖，則得到一個個臺階狀的圖形，最前面的成分有部分是純的，其他則互相重疊。類 別名 稱型 式不用支持體的電泳技術Tiselleas式微量電泳顯微電泳等電點聚焦電泳等速電泳密度梯度電泳屬自由電泳用支持體的電泳技術紙上電泳醋酸纖維薄膜電泳薄層電泳非凝膠性支持體區(qū)帶電泳支持體有：淀粉、纖維素粉、玻璃粉硅膠、合成樹脂粉末凝膠支持體區(qū)帶電泳(1)淀粉膠(2)聚丙烯酰胺①圓盤電泳法②平板法③SDS凝膠電泳法(3)瓊脂糖凝膠電泳(4)瓊脂凝膠電泳包括常壓、高壓電泳(水平式或垂直式)水平式或垂直式(平板法、柱形法及線絲法)垂直式(柱形法)垂直式或水平式垂直式(測分子量)平板法或柱形法(如免疫電泳)其他用法雙向電泳電泳—層析相結合交叉電泳紙連續(xù)低電泳（3）以電泳形式區(qū)分，有在液體介質(zhì)中進行的，有將支持物做成薄膜或薄層的，有板形或柱形的等。A、凝膠層的不連續(xù)性：三層不同的凝膠其作用如下：(sample gel)：為大孔膠，用光聚合法制備，樣品預先加在其中，起防止對流的作用，避免樣品跑到上面的緩沖液中，(目前電泳一般不制作此膠)。例如，分離蛋白質(zhì)樣品時，通常用氯根(Cl)為快離子，甘氨酸根負離子(NH2CH2COO)為慢離子，三羥甲基氨基甲烷(Tris+)作為緩沖配對離子。 在高電位梯度區(qū)和低電位梯度區(qū)之間的地方形成一個迅速移動的界面(圖7)，由于蛋白質(zhì)樣品的有效遷移率恰好介于快慢離子之間，因此也就聚焦在這個移動的界面附近，被濃縮形成一個狹小的中間層。在進入分離膠時，此種電荷效應仍起主要作用。v 夾心式垂直板電泳槽，v 微量注射器或微量進樣器：加樣時，由于需樣品量極小，作定量分析時要求樣品量準確，也可用50或100μl加液器代用。為防止?jié)B漏，在上下貯槽中加入略低于膠面的蒸餾水。當電極緩沖液離子強度確定后，又有穩(wěn)定電流和穩(wěn)定電壓兩種電泳方式。也可浸泡在用7%%三氯乙酸配制的染色液中，同時進行固定和染色。在水中用兩張比膠板稍大的玻璃紙，將膠板夾在中間，平放在玻璃板上，排除氣泡，四周用玻璃條壓住并用夾子固定在玻璃板上，30℃烘干或自然風干。因此在應用時，不管選擇什么PH范圍，一般都要加入其總量1/10的PH6～8的Ampholine溶液，以保持電場強度的均勻性；④ 分子量小 Ampholine一般分子量都在300～1000之間。 v 不同的凝膠濃度適用于不同的分子范圍 v 有許多蛋白質(zhì)，是由亞基或兩條以上肽鏈組成的，它們在SDS和巰基乙醇的作用下，解離成亞基或單條肽鏈。在一定條件下。優(yōu)點：點樣時無須點在電泳槽中、位置不受限制，分辨率高，操作方便，分離時間短，適于蛋白質(zhì)的微量分析載體：兩性電解質(zhì)，~，由羧酸與聚乙烯多胺在特殊條件下合成的無數(shù)種化合物的混合物，每種都有其特定的、略有不同的pI值。用氨基黑染色的，脫色時間較長，而考馬斯亮藍染料易于脫色。(E)卸板 電泳完畢，從冰箱中取出電泳槽，吸出電極緩沖液，將膠板從電泳槽上卸下，平放在實驗臺上，用壓舌板在兩塊玻璃板的一角輕輕一撬，揭去上面長型玻璃板。(D)電泳 加樣畢，%溴酚藍數(shù)滴，不要移動電泳槽(防引起樣品漂流)，接通電源，先低壓電泳一般時間，待指示劑在膠板上成一條直線時，即可將電泳槽移入冰箱，按所需電流電壓進行電泳。結晶置于真空干燥器中減壓干燥，貯棕色瓶中備用。由于這三種物理效應，使樣品分離效果好，分辨率高。此處分子篩效應是指樣品通過一定孔徑的凝膠時，小分子走在前面，大分子走在后面與凝膠層析的分子篩效應相反。它們的有效遷移率，按下列次序排列，mclαcl＞ m pαp＞ m GαG。樣品在其中進行電泳和分子篩分離，也有防對流作用，蛋白質(zhì)分子在大孔徑凝膠中受到的阻力小，移動速度快，進入小孔膠時遇到阻力大，速度就減慢了，由于凝膠的不連續(xù)性，在大孔與小孔凝膠的界面處就會使樣品濃縮，區(qū)帶變窄。在各類電泳技術中，尤以凝膠電泳在分離分析酶、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子等方面分辨力為最高，為生物化學，分子生物學的發(fā)展作出了重大貢獻。4) 等電聚焦 由多種具有不同等電點的載體兩性電解質(zhì)在電場中自動形成PH梯度，被分離物則各自移動到其等電點而聚成很窄的區(qū)帶，分辨率很高。（1）電泳按其分離的原理大致可分為4類① 區(qū)帶電泳（zone EP，ZEP）；② 移界電泳（moving boundary EP，MBEP）；③ 等速電泳（isotachophoresis，ITP）；④ 等電聚焦（isoelectric focusing，IEF）。 C、支持物多數(shù)電泳都有支持物，如紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳，然而支持物的結構與性質(zhì)對帶電顆粒的遷移率有很大影響，主要表現(xiàn)為對樣品的吸附、產(chǎn)生電滲與分子篩效應。b）濃度q 主要影響溶液的離子強度(μ)。n 電泳過程中會產(chǎn)生熱量，尤其是高壓電泳，因此高壓電泳槽要附有冷卻設備，常壓電泳可放在冰箱中降溫。⑩ 蓋好機蓋（防止灰塵落入）并將所有控制鍵調(diào)到零。確保離心管外壁、盛樣（管）器、樣品室是干燥的；液體除了可能會腐蝕轉(zhuǎn)子外，任何液體的存在都會導致離心過程的不平衡。因而，要準備同等大小的離心管，在轉(zhuǎn)子中相對放置，這一點對于密度梯度離心及含有密度差異很大的顆粒的樣品（如土壤樣品）的離心尤其重要，因為在這兩種情況下離心管內(nèi)的密度會隨著離心過程的進行而改變。167。n 使用微量離心管——將管帽正確地蓋到位，否則離心時可能脫落。多次高壓滅菌可能會導致聚碳酸酯崩裂或變形。詳細信息由廠家提供。（2）離心管離心管有各種大?。?mL到1000 mL）所用材料也不一。使用167。 （6）制備型離心機菌體、動植物細胞的收集，亞細胞結構、蛋白質(zhì)、核酸、激素和病毒等高分子化合物的研究（7）分析型離心機對已得物質(zhì)的純度、分子量、形狀進行推斷a) 連續(xù)檢測的光學系統(tǒng)：利用折射率不同建立分析圖象，測定沉降速度S，推算分子量b) 對試樣均質(zhì)性測定：分析沉降界面，單界面表均質(zhì)，雜質(zhì)在主峰附近有小峰c) 大分子構象研究d) 臨床應用：可分離高密度膽固醇和低密度膽固醇 離心機的結構轉(zhuǎn)動電機、轉(zhuǎn)頭、離心管、離心室、儀表、控制系統(tǒng)、制冷系統(tǒng)真空裝置（1）轉(zhuǎn)子許多離心機可以配用不同大小的離心管，只需要改變轉(zhuǎn)子或使用一個與不同的吊桶/適配器相配的轉(zhuǎn)子。最高速率可達到25 000 r/min，RCF達到60 000 g?，F(xiàn)代的這類離心機有一個傳感器，在轉(zhuǎn)子旋轉(zhuǎn)的過程中檢測到任何不平衡時立即自動切斷電源。需要精確的研究時，可以使用一種向上置換（upward displacement）技術收集各梯度溶液。l 差速區(qū)帶離心法：將樣品置于平緩的預先制備好的密度梯度介質(zhì)上，進行離心，較大的顆粒將比較小的顆粒更快地沉降通過梯度介質(zhì)，形成幾個明顯地區(qū)帶（條帶）。一種旋轉(zhuǎn)半徑r =155mm的典型臺式離心機的轉(zhuǎn)速（r/min）與加速度（相對離心力，RCF）之間的關系r/minRCF50030100013015002902000510250080030001160400020605000321060004630 離心分離的方法（1）差速沉降（沉淀）法l 將一混合懸浮液以一定的RCF離心一定的時間后，混合物將會被分為沉淀和上清液兩部分。7種常用菌種保藏方法的比較方法主要措施適宜菌種保藏期評價冰箱保藏法（斜面）低溫（4℃）各大類約1～6月簡便冰箱保藏法（半固體）低溫（4℃），避氧細菌，酵母菌約6～12月簡便石蠟油封藏法*低溫（4℃），阻氧各大類**約1～2年簡便甘油懸液保藏法低溫（－70℃），保護劑（15～50％甘油）細菌，酵母菌約10年較簡便砂土保藏法干燥，無營養(yǎng)產(chǎn)孢子的微生物約1～10年簡便有效冷凍干燥保藏法干燥、低溫、無氧，有保護劑各大類5~15年繁而高效液氮保藏法超低溫（－196℃），有保護劑各大類15年繁而高效*用斜面或半固體穿刺培養(yǎng)物均可，一般置于4℃下。分裝：在無菌條件下，將細胞懸液（從平板上打下直徑為5cm的菌塊）分裝于安培瓶中，并注入保護劑，擰緊螺旋蓋。保藏菌菌齡：處于最大生長量階段或?qū)?shù)生長期后期。菌種冷凍真空干燥用的保護劑保護劑成分脫脂牛奶脫脂牛奶（Difco），20%（V/V），116℃，20min蒸汽滅菌脫脂牛奶－谷氨酸鈉脫脂牛奶10％谷氨酸鈉1％脫脂牛奶－蔗糖－谷氨酸鈉脫脂牛奶3％蔗糖5％谷氨酸鈉1％蔗糖－新鮮液體培養(yǎng)液24％蔗糖50％新鮮液體培養(yǎng)基50％血清馬血清（不稀釋）過濾除菌冷凍真空干燥操作注意事項操作階段影響菌細胞生存因素最適條件菌種培養(yǎng)培養(yǎng)基組成培養(yǎng)條件培養(yǎng)時間生長良好，形成健壯的細胞或孢子，一般在對數(shù)制備菌懸液保護劑組