【文章內(nèi)容簡介】 微生物細胞處于半永久的休眠狀態(tài)，從而達到長久保藏的目的。菌種冷凍真空干燥用的保護劑保護劑成分脫脂牛奶脫脂牛奶（Difco），20%（V/V），116℃，20min蒸汽滅菌脫脂牛奶－谷氨酸鈉脫脂牛奶10％谷氨酸鈉1％脫脂牛奶－蔗糖－谷氨酸鈉脫脂牛奶3％蔗糖5％谷氨酸鈉1％蔗糖－新鮮液體培養(yǎng)液24％蔗糖50％新鮮液體培養(yǎng)基50％血清馬血清（不稀釋）過濾除菌冷凍真空干燥操作注意事項操作階段影響菌細胞生存因素最適條件菌種培養(yǎng)培養(yǎng)基組成培養(yǎng)條件培養(yǎng)時間生長良好，形成健壯的細胞或孢子，一般在對數(shù)制備菌懸液保護劑組成菌細胞濃度脫脂牛奶，血清等濃稠的好預(yù)備冷凍冷凍速度達到的溫度急速冷凍，緩慢冷凍（酵母菌）共晶點以下真空干燥一次（升華），溫度共晶點以下熔封氣相真空度共晶點以下（低的更好）保藏溫度光低溫避光暗處恢復(fù)培養(yǎng)復(fù)水液組成，溫度培養(yǎng)基組成和條件一般液體培養(yǎng)基，一般常溫一般使用的最適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件E. 干燥保藏法F. 液氮超低溫保藏法① 菌種保藏在液氮超低溫（196℃）中，是目前比較理想的一種菌種保藏方法。② 適用于各種菌種的保藏，特別適于難以冷凍真空干燥等方法保藏的菌種。③ 保藏期較長，菌種的變異較小。④ 投資費用較大，并要一個可靠的氮源。液氮超低溫保藏程序容器的選擇：使用帶螺旋蓋的2ml塑料安培瓶。檢查安培瓶是否滲漏：%的亞甲基藍水溶液在4℃浸泡3045分鐘，沖洗干凈，棄去含有藍色染料的安培瓶，其余的安培瓶備用。打印標簽（激光打印）。容器的滅菌：先用蒸餾水漂洗干凈安培瓶，再用蒸餾水在滅菌鍋中121℃浸泡滅菌15分鐘，干燥并將打印好的標簽放入安培瓶中，略擰緊螺旋蓋，再行121℃滅菌30分鐘。保藏菌菌齡：處于最大生長量階段或?qū)?shù)生長期后期。保護劑：選用510%的甘油或二甲基亞砜作保護劑。1）甘油的準備：在121℃滅菌15min，28℃貯存。甘油一般以兩倍最終所需濃度的水溶液保存，然后與同等量的細胞懸液混合。若不用細胞懸液，則以最終所需濃度的水溶液保存。2）二甲基亞砜：。過濾膜預(yù)先用甲醇和二甲基亞砜漂洗。無菌的二甲基亞砜以1015ml裝量28℃避光保存。分裝：在無菌條件下，將細胞懸液（從平板上打下直徑為5cm的菌塊）分裝于安培瓶中，并注入保護劑，擰緊螺旋蓋。將安培瓶固定在鋁夾上，貼好標簽。為了便于取用，一般一個鋁夾上僅放一個菌株。將控溫系統(tǒng)先預(yù)冷到4℃，再將鋁夾放入其中。以每分鐘1℃降溫至40℃，然后以每分鐘10℃降溫至90℃。降溫以后，將鋁夾轉(zhuǎn)移至處于液氮中的儲存器中保存。菌種的復(fù)活：將液氮保藏的菌種取出，迅速放入37℃水浴中解凍。,等完全解凍后，再及時轉(zhuǎn)接到合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。7種常用菌種保藏方法的比較方法主要措施適宜菌種保藏期評價冰箱保藏法（斜面）低溫（4℃）各大類約1～6月簡便冰箱保藏法（半固體）低溫（4℃），避氧細菌，酵母菌約6～12月簡便石蠟油封藏法*低溫（4℃），阻氧各大類**約1～2年簡便甘油懸液保藏法低溫（－70℃），保護劑（15～50％甘油）細菌，酵母菌約10年較簡便砂土保藏法干燥，無營養(yǎng)產(chǎn)孢子的微生物約1～10年簡便有效冷凍干燥保藏法干燥、低溫、無氧，有保護劑各大類5~15年繁而高效液氮保藏法超低溫（－196℃），有保護劑各大類15年繁而高效*用斜面或半固體穿刺培養(yǎng)物均可，一般置于4℃下。**對石油發(fā)酵微生物不適宜。3. 菌種保藏的注意事項① 菌種在保藏前所處的狀態(tài)② 菌種保藏所用的基質(zhì)③ 操作過程對細胞結(jié)構(gòu)的損害（四）病毒的保存1. –5℃冰箱保存；2. 10%的甘油混合，20~ 70℃冰箱保存；3. 液氮保存；4. 20%的脫脂牛奶凍干保存，回復(fù)時用1%的多肽蛋白胨 （牛奶離心、去上層脂肪，5000轉(zhuǎn)，5~10min ）（五）微小藻類的保存a) 斜面?zhèn)鞔鷅) 加人或馬的血清凍干c) 加10%的甘油液氮保存（六）原生動物的保存非病原：加10%的2甲基亞砜于20℃冰箱保存病原：檸檬酸+人血+等量的10%甘油，于4℃平衡、－70℃冰箱降溫、－30℃以下液氮保存。（七）菌種保藏機構(gòu)1. 保藏對象：① 各種微生物（病毒）；② 細胞系（動物或植物）；③ 雜交瘤；④ 體外質(zhì)粒；⑤ 植物組織培養(yǎng)物 2. 保藏機構(gòu)：① 世界培養(yǎng)物保藏組織（不保藏菌種，只保存資料）② 中國微生物菌種保藏管理委員會國內(nèi)1）普通微生物菌種保藏中心：中科院武漢病毒所2）農(nóng)業(yè)微生物保藏管理中心：中國農(nóng)科院3）工業(yè)微生物保藏管理中心：輕工部食品發(fā)酵研究所4）醫(yī)藥微生物保藏管理中心：a. 細菌：衛(wèi)生部b. 真菌：中國醫(yī)科院皮膚病研究所（南京）c. 病毒：中國醫(yī)科院病毒所d. 新抗生素：四川抗生素工業(yè)研究所e. 生產(chǎn)用抗生素：華北制藥廠5）獸醫(yī)微生物保藏管理中心：農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)微生物研究所6）CCTCC: Chinese Centre for Type Cultures Collections, Wuhan University, Wuhan, Hubei, 430072, China.國外1） 美國典型菌種收藏館（ATCC）不承擔鑒定業(yè)務(wù)，工業(yè)菌種收費保藏，教學科研菌種免費供應(yīng) 2）美國農(nóng)業(yè)研究服務(wù)處菌種收藏館3）英國國立標準菌種貯藏所：不收集不能形成凍干保存的菌種4）法國巴斯德研究所：教學科研免費5）德國微生物和細胞收藏所6）日本微生物菌種保藏聯(lián)合會（JFCC） 第三章 微生物研究中物理化學方法基礎(chǔ)第一節(jié) 離心、電泳原理和方法沉降系數(shù)、梯度離心、泳動度、影響電泳的條件，電泳分類，應(yīng)用一、 離心技術(shù)（固液分離及不同密度液體分離）原理利用高度旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力分離、純化制備實驗材料，并研究其生物學活性的實驗方法 a) 離心機是一種通過使樣品繞離心轉(zhuǎn)軸的中心旋轉(zhuǎn)而在其上產(chǎn)生一個遠大于地球重力的離心力的機器。b) 顆粒的沉降速度取決于離心機的轉(zhuǎn)速及其自身與中心軸距離。不同大小、形狀和密度的顆粒會以不同的速度沉降。離心力的計算離心機的加速度通常以重力加速度（g= m/s2）的倍數(shù)來表示，稱為相對離心力（RCF或“g值”）。RCF取決于轉(zhuǎn)子（n，以每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)計r/min）和旋轉(zhuǎn)半徑（r，以mm計），可用公式表示如下：RCF＝ r （n/1000）178。一種旋轉(zhuǎn)半徑r =155mm的典型臺式離心機的轉(zhuǎn)速（r/min）與加速度（相對離心力，RCF）之間的關(guān)系r/minRCF50030100013015002902000510250080030001160400020605000321060004630 離心分離的方法（1）差速沉降（沉淀）法l 將一混合懸浮液以一定的RCF離心一定的時間后，混合物將會被分為沉淀和上清液兩部分。l 從一種懸浮液中，增加RCF，以固定的離心時間連續(xù)分離沉淀的方法被廣泛應(yīng)用于從細胞勻漿中分離細胞器。① 離心前盛在離心管內(nèi)的是含有大、中、小三種顆粒的懸浮液。② 低速離心后，沉淀主要由最大的顆粒組成。③ 進一步用高速離心上清液，得到主要由中等大小顆粒組成的第二種沉淀。④ 最后一步用離心把余下的小顆粒沉淀下來。注意除了最后一種沉淀，所有沉淀都有一定程度的交叉混雜物。（2）密度梯度離心法密度梯度——離心管中的溶液從管頂?shù)焦艿酌芏戎饾u增加。l 差速區(qū)帶離心法：將樣品置于平緩的預(yù)先制備好的密度梯度介質(zhì)上，進行離心，較大的顆粒將比較小的顆粒更快地沉降通過梯度介質(zhì)，形成幾個明顯地區(qū)帶（條帶）。這種方法有時間限制，在任一區(qū)帶到達管底之前必須停止離心。l 等密度離心法：這種技術(shù)根據(jù)浮力密度的不同分離物質(zhì)。幾種物質(zhì)可通過離心法形成密度梯度（如蔗糖、葡萄糖、菲可、珀可、尼可登）。將樣品與適當?shù)慕橘|(zhì)混合后離心——各種顆粒在與其等密度的介質(zhì)帶處形成沉降區(qū)帶。這種方法要求介質(zhì)梯度應(yīng)有一定的陡度，要有足夠的離心時間形成梯度顆粒的再分配，進一步離心對其不會有影響。l 可以使用一根細的巴氏滴管或帶有細長針頭的注射器來收集某一密度梯度內(nèi)的條帶。另一種方法可將試管刺穿，將內(nèi)容物分段逐滴收集到幾個管中。需要精確的研究時，可以使用一種向上置換（upward displacement）技術(shù)收集各梯度溶液。（3）密度屏障離心一種單梯度密度屏障，如利用一層用苯二甲酸二壬酯調(diào)節(jié)到正確密度的硅酮油可以將細胞從其周圍液相中分離出來。血紅細胞可以使用像ficoll這樣的等密度屏障分離出來。使用硅酮油——硅酮油的密度對溫度敏感，因而操作時要處在一個已知溫度的恒溫環(huán)境，否則將會失敗。差速離心：高低速離心交替進行，用于沉降速度差別大的物質(zhì)密度梯度離心：適用于沉降粒子差別小的情況（形成密度梯度的介質(zhì)：蔗糖、甘油）平衡等密度梯度離心： 用氯化銫與樣品混合均勻，離心時氯化銫自行形成密度梯度（氯化銫濃度在備份物質(zhì)的密度范圍之內(nèi)）差速離心舉例167。 CaCO3+菌懸液先低速離心除去CaCO3 ，再高速離心收集菌體167。 大型真菌+小型真菌先低速離心，后高速離心 離心機的類型及使用按速度分：低速離心機、高速離心機、超速離心機按處理量分：微量離心機、大容量離心機按溫度分：常溫離心機、冷凍離心機（1）低速離心機低速離心機是一種常規(guī)使用的臺式儀器，最大速率為3000－6000 r/min，RCF可達到6000 g。常用于收集細胞、較大的細胞器（如細胞核、葉綠體）及粗粒沉淀（如抗體抗原復(fù)合物）?，F(xiàn)代的這類離心機有一個傳感器，在轉(zhuǎn)子旋轉(zhuǎn)的過程中檢測到任何不平衡時立即自動切斷電源。然而，一些老式的機器并沒有這種裝置，因而一旦發(fā)現(xiàn)震動必須立即關(guān)掉，以防止轉(zhuǎn)子被損壞或傷害到操作者。（2）微量離心機微量離心機是一種臺式儀器，它能夠迅速加速到12 000 r/min和10 000 g。常用于短時間內(nèi)（ min）對大顆粒沉淀（如細胞、沉淀物）、小體積溶液（ mL）的沉降。尤其用于從液體介質(zhì)如硅酮油中快速分離細胞。（3）連續(xù)液流式離心機連續(xù)液流式離心機用于從細胞的生長培養(yǎng)基中收集大量細胞。離心過程中，顆粒隨著液體經(jīng)轉(zhuǎn)子流出。 （4）高速離心機高速離心機通常為較大的立式儀器。最高速率可達到25 000 r/min，RCF達到60 000 g。用于分離微生物細胞和許多細胞器（如線粒體、溶酶體等）及蛋白質(zhì)沉淀物。這種離心機經(jīng)常具有一個制冷系統(tǒng)來冷卻高速旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)子。通常要在有人直接監(jiān)控下使用。（5）超速離心機這是一類速度非常高的離心機，最大轉(zhuǎn)速超過了30 000 r/min，最大RCF可達到600 000 g。具有精密的制冷和真空系統(tǒng)。用于沉淀小的細胞器（如核糖體、膜泡）及生物大分子。一般情況下超速離心機要有專門的管理人員操作。 （6）制備型離心機菌體、動植物細胞的收集，亞細胞結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)、核酸、激素和病毒等高分子化合物的研究（7）分析型離心機對已得物質(zhì)的純度、分子量、形狀進行推斷a) 連續(xù)檢測的光學系統(tǒng)：利用折射率不同建立分析圖象，測定沉降速度S，推算分子量b) 對試樣均質(zhì)性測定：分析沉降界面，單界面表均質(zhì)，雜質(zhì)在主峰附近有小峰c) 大分子構(gòu)象研究d) 臨床應(yīng)用：可分離高密度膽固醇和低密度膽固醇 離心機的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)動電機、轉(zhuǎn)頭、離心管、離心室、儀表、控制系統(tǒng)、制冷系統(tǒng)真空裝置（1）轉(zhuǎn)子許多離心機可以配用不同大小的離心管，只需要改變轉(zhuǎn)子或使用一個與不同的吊桶/適配器相配的轉(zhuǎn)子。a. 水平轉(zhuǎn)子：盛樣品的離心管放在吊桶內(nèi)，以轉(zhuǎn)子的加速度運轉(zhuǎn)。水平轉(zhuǎn)子用于低速離心機，其主要缺陷是延長了沉淀的路徑。同時，減速過程中產(chǎn)生的對流會引起沉淀物的重新懸浮。b. 角式轉(zhuǎn)子：許多高速離心機及微量離心機安裝。由于沉降路徑短，沉淀顆粒時角式轉(zhuǎn)子比水平轉(zhuǎn)子的效率更高。c. 垂直管轉(zhuǎn)子：用于高速及超高速離心機進行等密度梯度離心時。這種轉(zhuǎn)子在沉淀沒有形成之前不能用來收集懸浮液中的顆粒。使用167。 更換轉(zhuǎn)子——若需要更換轉(zhuǎn)子，一定要正確的搬移（切忌碰撞或掉在地上），要正確的裝在離心機上（用扳手固定在正確的位置上）。進行正確保存（用完后擦洗干凈，不要到處亂放）。167。 平衡轉(zhuǎn)子——為確保離心機的安全運轉(zhuǎn)，使用時必須平衡轉(zhuǎn)子，否則轉(zhuǎn)軸及轉(zhuǎn)子組件可能會損壞；嚴重時轉(zhuǎn)子可能會停轉(zhuǎn)，造成事故。167。 要點：使用前平衡離心管至關(guān)重要，通常的原則是用托盤天平平衡所有樣品管，差值控制在1％以內(nèi)或更少。把平衡好的試管成對放在相對的位置上。（2）離心管離心管有各種大?。?mL到1000 mL）所用材料也不一。 選擇離心管時應(yīng)考慮的一些性能。 a. 容量。由樣品的體積決定。注意在有些應(yīng)用中（如高速離心）離心管必須裝滿。b. 形狀。收集沉淀時，用圓錐形管底的離心管較好，而進行密度梯度離心時圓底試管更有用。c. 最大離心力。詳細信息由廠家提供。標準的Pyrex玻璃管僅可用于低速離心（小于2 000 g）。d. 耐腐蝕性。玻璃管是惰性物質(zhì)，聚碳酸酯管對有機溶劑（如乙醇、丙酮）敏感，而聚丙烯具有更好的耐腐蝕性。詳細信息可參考廠家的說明書。e. 滅菌。玻璃管和聚丙烯管可重復(fù)滅菌使用。纖維素酯管不可高壓滅菌。多次高壓滅菌可能會導致聚碳酸酯崩裂或變形。f. 透明度。玻璃管和聚碳酸酯管是透明的，而聚丙烯管為半透明。g. 能否刺穿。若你想用刺穿管壁的方法收集樣品，纖維素乙酸管和聚丙烯管易于用注射管針