病原微生物檢測方法(編輯修改稿)
2025-09-11 23:48 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 所以樣品用量少，試驗結(jié)果可通過顏色斑點的出現(xiàn)與否和色澤進行判定，不需特殊儀器 。 12 檢測灰飛虱帶 RBSDV的 DIBA法 13 1,NC膜用鉛筆畫出 2,單頭灰飛虱加 100ul碳酸鹽緩沖液，用牙簽搗碎，取上清 2ul加樣，室溫晾干 3,將干燥的 NC膜浸入封閉液中，37 ℃ ,30min 4,取出 NC膜，浸入用封閉液稀釋 10000倍的單抗體中， 37 ℃ , 5,取出膜，用 3次，每次5min 6,將膜浸入用封閉液稀釋 5000倍的酶標二抗中， 37 ℃ , 7,取出膜，用 3次，每次 5min 8,將膜浸入 HRP底物顯色液中， 37 ℃ ,30min，顯色后，用自來水沖洗，室溫晾干 核酸雜交法 ? 原理： 是通過標記根據(jù)病原體核酸片段制備的探針，與病原體核酸片段雜交 ,觀察是否產(chǎn)生特異的雜交信號。核酸雜交有原位雜交、打點雜交、斑點雜交、 Southern 雜交、 Northern 雜交等。核酸分子探針又可根據(jù)它們的來源和性質(zhì)分為 DNA 探針、 cDNA 探針、 RNA 探針及人工合成的寡聚核苷酸探針等。 14 斑點雜交 ? 被廣泛用于檢測植物或介體帶毒及核酸同源性。如果用于檢測 RNA樣品，稱為 Northern雜交；如果用于檢測 DNA樣品，稱為 Southern雜交。操作程序如下： 1,從病株材料中提取少量汁液。如果病毒核酸為雙鏈，通過加熱使其變性。 2,點樣。將病株汁液滴在 NC膜上或尼龍膜上。 3,烘烤纖維素膜，使核酸牢固地結(jié)合到纖維膜上。 4,用蛋白和非特異性小分子 DNA溶液混合進行預(yù)雜交約2小時，封閉膜上的非特異性位點。 5,用標記的核酸探針與膜上樣品在封閉塑料袋中進行雜交過夜，水浴 65℃ 。洗膜后進行放射自顯影分析。 15 斑點雜交 16 DNA/RNA 樣品 放射自顯影檢測 點樣 Probe32P A B 1 2 3 4 SOUTHERN BLOT 17 PCR及其衍生技術(shù) ?PCR 技術(shù)又稱體外擴增技術(shù) ,具有高度的靈敏性和良好的特異性。各種衍生技術(shù)如反轉(zhuǎn)錄PCR ( RTPCR) 、多重 PCR 、巢式 PCR 、 PCR 單鏈構(gòu)象多態(tài)性 ( PCRSSCP
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