【正文】 SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還引起了蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變，測(cè)定時(shí)，通常選用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)作為“標(biāo)記物”(maker)，與分子量未知的待測(cè)蛋白質(zhì)樣品在同一條件下進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上與分子量的對(duì)數(shù)作圖，可得到一條lgMWmR的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出待測(cè)蛋白質(zhì)樣品的mR所對(duì)應(yīng)的lgMW，即可求得分子量。目前常用的載體兩性電解質(zhì)商品有ampholine(LKB公司)、Pharmlyte(Pharmacia)、Serralyte(Serva)以及國(guó)產(chǎn)的Ampholine(上海生化所東風(fēng)廠生產(chǎn))。即在一玻璃或有機(jī)玻璃槽中盛7%的乙酸溶液，已染色的膠放置在槽中間，兩邊加鉑金電極，并通直流電，電壓30～40V，1～2小時(shí)即可脫色完畢。(F)固定與染色為防止凝膠柱內(nèi)已分離成分的擴(kuò)散，需要進(jìn)行固定。由于電流和電壓同電極緩沖液的離子強(qiáng)度有關(guān)，因此根據(jù)電極緩沖液分高離子強(qiáng)度和低離子強(qiáng)度兩種。C、操作技術(shù)(A)安裝夾心式垂直板電泳槽 夾心式垂直板電泳槽(圖11)兩側(cè)為有機(jī)玻璃制成的電極槽，兩電極槽中間有一凝膠模(圖12)，該模由ㄩ形硅膠框，長(zhǎng)、短玻璃板，模板梳組成，電泳槽由上貯槽(白金電極面對(duì)短玻璃板)，下貯槽(白金電極面對(duì)長(zhǎng)玻璃板)和回紋冷凝管組成，兩電極槽與凝膠模間靠貯液槽螺絲固定，其組裝順序?yàn)椋孩傺b貯槽和固定螺絲銷釘；②將洗凈的長(zhǎng)、短玻璃板分別插到ㄩ形硅橡膠框的凹形槽中，注意不要用手接觸灌膠面的玻璃；③將已插好玻板的凝膠模夾到貯槽中，短玻璃板應(yīng)面對(duì)上貯槽，長(zhǎng)玻璃板應(yīng)面對(duì)下貯槽，雙手以對(duì)角線的方式旋緊螺絲帽；④豎直電泳槽，用滴管吸取少量的1%瓊脂糖溶液，灌入凝膠模板底部(長(zhǎng)玻璃板外側(cè)，下沿凹形小槽內(nèi))，～,待瓊脂糖凝固后,即堵住凝膠模下面的窄縫(通電時(shí)又可作為鹽橋)。 其中，bisN，N’甲叉雙丙烯酰胺 作為膠粘劑，促丙烯酰胺聚合原理： Tris甘氨酸緩沖液等電點(diǎn)6左右,(HCl完全電離).樣品膠中加入trisHCl系統(tǒng)， HCl完全解離， tris ~1%， Cl離子遷移最快，有效泳動(dòng)率（泳動(dòng)率 X 解離度）： Cl離子樣品 ,Cl離子在樣品前，樣品后形成濃度低的電導(dǎo)區(qū)，在低電導(dǎo)區(qū)產(chǎn)生較高的電勢(shì)梯度，推動(dòng)樣品和tris快速運(yùn)動(dòng)，樣品介于快、慢離子間，從而形成壓縮移動(dòng)界面，進(jìn)入分離膠后，按各自分子的大小和電荷的不同而分離（大分子在前）。蛋白質(zhì)混合物在膠界面處被高度濃縮，堆積成層，形成一狹小的高濃度的蛋白質(zhì)區(qū)，但由于每種蛋白質(zhì)分子所載有效電荷不同，因而遷移率不同。樣品分離(圖6C) 當(dāng)樣品達(dá)到濃凝膠與分離界面處，離子界面繼續(xù)前進(jìn)，蛋白質(zhì)被留在后面，然后分成多個(gè)區(qū)帶。為了使樣品達(dá)到濃縮的目的，需在電泳緩沖系統(tǒng)中加入有效遷移率大小不同的兩種離子，并使這兩種離子在緩沖系統(tǒng)中組成不連續(xù)的兩相，即在三層凝膠中加入快離子，在電極緩沖液中加入慢離子。2）移界電泳：膠體粒子以各自的運(yùn)動(dòng)速度在膠體溶液與溶劑間形成的界面稱移動(dòng)界面電泳或自由界面電泳3）等速電泳：靠電場(chǎng)的聚膠效應(yīng)使混合電解質(zhì)溶液各界面以等速運(yùn)動(dòng)并使各物質(zhì)得以分離聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PGPE）（1）電泳原理在區(qū)帶電泳原理的基礎(chǔ)上，以孔徑大小不同的聚丙烯酰胺凝膠作為支持物，采用電泳基質(zhì)的不連續(xù)性體系（即凝膠層的不連續(xù)性、緩沖液離子成分的不連續(xù)性、pH的不連續(xù)性及電位梯度的不連續(xù)性），使樣品在不連續(xù)性的兩相間積聚濃縮成很薄的起始區(qū)帶（厚度為102 cm），然后再進(jìn)行電泳分離。此為微量電泳方法。電泳的區(qū)帶隨時(shí)間延長(zhǎng)和距離加大而擴(kuò)散嚴(yán)重，影響分辨率。② 在電場(chǎng)中液體對(duì)于團(tuán)體支持物的相對(duì)移動(dòng)稱為電滲。q 緩沖溶液濃度低時(shí)，離子強(qiáng)度減少，會(huì)影響溶液的導(dǎo)電性，樣品分子擴(kuò)散加重，分辨率下降。pH)。在生物化學(xué)及分子生物學(xué)中，主要是根據(jù)生物大分子所帶電荷的數(shù)量及其在分子表面排布的不同來(lái)對(duì)它們進(jìn)行分離和鑒定。平衡好的離心管必須擺放在相對(duì)的位置上——要使用一些簡(jiǎn)單的代碼以防混淆。④ 平衡每一對(duì)樣品管（必要時(shí)蓋上管帽）， g 以內(nèi)的托盤天平（toppan balance）；逐滴滴加液體到較輕的管中直到達(dá)到平衡所需重量。167。注意一個(gè)35 mL盛滿液體的試管在3 000 g RCF的加速下旋轉(zhuǎn)，其有效重量要大于一個(gè)大塊頭的成年男子。玻璃管和聚碳酸酯管是透明的，而聚丙烯管為半透明。d. 耐腐蝕性。 a. 容量。進(jìn)行正確保存（用完后擦洗干凈，不要到處亂放）。水平轉(zhuǎn)子用于低速離心機(jī)，其主要缺陷是延長(zhǎng)了沉淀的路徑。這種離心機(jī)經(jīng)常具有一個(gè)制冷系統(tǒng)來(lái)冷卻高速旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)子。（2）微量離心機(jī)微量離心機(jī)是一種臺(tái)式儀器，它能夠迅速加速到12 000 r/min和10 000 g。血紅細(xì)胞可以使用像ficoll這樣的等密度屏障分離出來(lái)。l 等密度離心法：這種技術(shù)根據(jù)浮力密度的不同分離物質(zhì)。① 離心前盛在離心管內(nèi)的是含有大、中、小三種顆粒的懸浮液。3. 菌種保藏的注意事項(xiàng)① 菌種在保藏前所處的狀態(tài)② 菌種保藏所用的基質(zhì)③ 操作過(guò)程對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損害（四）病毒的保存1. –5℃冰箱保存；2. 10%的甘油混合，20~ 70℃冰箱保存；3. 液氮保存；4. 20%的脫脂牛奶凍干保存，回復(fù)時(shí)用1%的多肽蛋白胨 （牛奶離心、去上層脂肪，5000轉(zhuǎn)，5~10min ）（五）微小藻類的保存a) 斜面?zhèn)鞔鷅) 加人或馬的血清凍干c) 加10%的甘油液氮保存（六）原生動(dòng)物的保存非病原：加10%的2甲基亞砜于20℃冰箱保存病原：檸檬酸+人血+等量的10%甘油，于4℃平衡、－70℃冰箱降溫、－30℃以下液氮保存。為了便于取用，一般一個(gè)鋁夾上僅放一個(gè)菌株。1）甘油的準(zhǔn)備：在121℃滅菌15min，28℃貯存。③ 保藏期較長(zhǎng)，菌種的變異較小。c) 按沙土比5:2混合，裝入硬質(zhì)玻璃小試管，約2/5高度，加塞高壓滅菌，121℃30min，滅菌2次，烘干備用。b) 石蠟油滅菌至少2次，121℃30min，第二次滅完后置50℃烘箱干燥2h以上，除去濕熱滅菌過(guò)程中進(jìn)入的水汽，以免石蠟油保護(hù)雜菌。① 常用的細(xì)菌培養(yǎng)基（牛肉膏瓊脂、酵母膏葡萄糖瓊脂、甘露醇瓊脂）② 常用的放線菌保藏培養(yǎng)基（高氏合成一號(hào)）③ 常用的酵母菌保藏培養(yǎng)基（麥芽汁瓊脂）④ 常用的霉菌保藏培養(yǎng)基（Czapek agar、馬鈴薯瓊脂）《菌種保藏手冊(cè)》介紹了406種培養(yǎng)基的成分、配方和用途。應(yīng)用① 研究培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)呼吸的影響；② 比較抑菌劑的作用大小及速度；③ 研究某種營(yíng)養(yǎng)的呼吸熵，推斷該營(yíng)養(yǎng)是否被氧化；④ 探索新的生長(zhǎng)因子在應(yīng)用休止細(xì)胞前，可在室溫通氣或振蕩以消耗菌體細(xì)胞內(nèi)得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，減低內(nèi)源性呼吸，避免在實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生誤差。箱體結(jié)構(gòu)嚴(yán)密、不透氣，其內(nèi)始終充滿成分為N2:CO2:H2=85:5:10（V/V）的惰性氣體，并有鈀催化劑保證箱內(nèi)處于高度無(wú)氧狀態(tài)。V. Hungate技術(shù)（hungate rolltube technique） ，故名。攪拌的目的除增加溶解氧以外，可使培養(yǎng)液中的微生物均勻分散在種子罐內(nèi)，促進(jìn)熱傳遞，以及pH均勻，并使加入的酸和堿均勻分散等。III. 深層培養(yǎng)一種大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的液體培養(yǎng)方法。固體培養(yǎng)法為了盡量得到充足的氧氣，可把好氣性微生物培養(yǎng)在固體培養(yǎng)基的表面，如斜面和平板的表面等。）第三節(jié) 培養(yǎng)基設(shè)計(jì)制備、大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)、好氧與厭氧培養(yǎng)技術(shù)一、 培養(yǎng)基 定義：人工配制的適合微生物生長(zhǎng)代謝、繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。過(guò)濾液進(jìn)行真空濃縮（60 ℃）。以殺滅嗜熱脂肪芽胞桿菌（121℃，10min）為依據(jù)（2）高壓蒸汽滅菌鍋的種類臥式、手提式、立式（3）濕熱滅菌出現(xiàn)的問(wèn)題I. 培養(yǎng)基發(fā)生渾濁或沉淀a. 蛋白質(zhì)大分子凝固b. 鈣、鎂等的二、三價(jià)離子與可溶性磷酸鹽形成沉淀 措施：分開滅菌II. 改變和破壞營(yíng)養(yǎng)成分糖在加熱條件下產(chǎn)生褐色物質(zhì)冷凝水使體積增加酸性條件下滅菌更徹底，只需要煮沸5min措施：葡萄糖滅菌115℃，20—30min（4）間歇滅菌適用于蛋清、牛乳等不耐熱的培養(yǎng)基方法：60—70℃滅菌30min→37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜→反復(fù)5—6次 化學(xué)藥劑滅菌法某些化學(xué)藥劑能與微生物發(fā)生反應(yīng)而具有殺菌的作用。除紫外線外，X射線和γ射線也可進(jìn)行滅菌。滅菌、消毒、防腐、化療的比較比較項(xiàng)目滅菌消毒防腐化療處理因素強(qiáng)理、化因素理化因素理化因素化學(xué)治療劑處理對(duì)象任何物體內(nèi)外生物體表，酒、乳等有機(jī)質(zhì)物體內(nèi)外宿主體內(nèi)微生物類型一切微生物有關(guān)病原菌一切微生物有關(guān)病原菌對(duì)微生物作用徹底殺死殺死或抑制抑制或殺死抑制或殺死實(shí)例加壓蒸汽滅菌，輻射滅菌，化學(xué)殺菌劑70％酒精消毒，巴氏消毒法冷藏，干燥，糖漬，鹽腌，缺氧，化學(xué)防腐劑抗生素，磺胺藥，生物藥物素二、 滅菌的方法 干熱滅菌法: 干熱滅菌所需的溫度要高，時(shí)間要長(zhǎng)，一般160～170℃、2h，到達(dá)160 ℃之后開始計(jì)時(shí)。 ⑤ 高酸度：在我國(guó)和韓國(guó)等具有悠久歷史的泡菜，就是利用乳酸菌的厭氧發(fā)酵使新鮮蔬菜產(chǎn)生大量乳酸，借這種高酸度而達(dá)到抑制雜菌和防霉腐的目的。一種采用較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體或動(dòng)、植物有害的病原菌，而對(duì)被消毒的對(duì)象基本無(wú)害的措施。例如：常用的對(duì)皮膚、水果、飲用水進(jìn)行藥劑消毒的方法對(duì)啤酒、牛奶、果汁和醬油等進(jìn)行消毒處理的巴氏消毒法1） 巴氏消毒法（pasteurization）2）煮沸消毒法采用在100℃下煮沸數(shù)分鐘的方法，一般用于飲用水的消毒。 ⑥ 高醇度：用白酒或黃酒保存食品，在我國(guó)有悠久傳統(tǒng)，如：醉蟹、醉麩、醉筍和黃泥螺等產(chǎn)品，都是特色風(fēng)味食品。 實(shí)際應(yīng)用時(shí)，對(duì)一些要求保持干燥的實(shí)驗(yàn)器具和材料可以采用干熱滅菌法。 超聲波、微波 （均勻、快速） 濕熱滅菌法：最常使用又最簡(jiǎn)單的物理方法是加熱滅菌。化學(xué)藥劑適用于生產(chǎn)車間環(huán)境的滅菌，接種操作前小型器具的滅菌等。真空中，水60℃蒸發(fā)，記錄體積。 培養(yǎng)基的類型和用途根據(jù)來(lái)源分：天然培養(yǎng)基馬鈴薯合成培養(yǎng)基無(wú)氮培養(yǎng)基半合成培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基根據(jù)狀態(tài)分固體培養(yǎng)基適于微生物的保存、計(jì)數(shù)、純化、分離液體培養(yǎng)基適于觀察微生物生長(zhǎng)代謝半固體培養(yǎng)基（~%）適于觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性③ 根據(jù)主要成分或使用目的分：A. 基礎(chǔ)培養(yǎng)基B. 增殖培養(yǎng)基C. 鑒別培養(yǎng)基（eg.：乳糖培養(yǎng)基，應(yīng)用于水質(zhì)檢測(cè)）D. 選擇培養(yǎng)基（在培養(yǎng)基中添加某些物質(zhì)使特定微生物得以生長(zhǎng)而其它不生長(zhǎng)eg.：無(wú)氮培養(yǎng)基、抗生素培養(yǎng)基）無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：培養(yǎng)自養(yǎng)微生物，eg.：硅膠平板④ 根據(jù)生產(chǎn)工業(yè)的要求分：孢子培養(yǎng)基——供制備孢子用；種子培養(yǎng)基——滿足菌種生長(zhǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)基——滿足大生產(chǎn)中大量菌體生長(zhǎng)和繁殖以及代謝產(chǎn)物積累⑤ 無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：培養(yǎng)自養(yǎng)微生物，eg.：硅膠平板⑥ 活組織培養(yǎng)基：雞胚、單層細(xì)胞、昆蟲、高等動(dòng)物，用于培養(yǎng)病毒、立克次氏體等專性寄生微生物 成分n 能源：有機(jī)能、無(wú)機(jī)鹽、光源n 碳源：作為細(xì)胞骨架n 氮源：合成蛋白質(zhì)n 生長(zhǎng)因子：嘌呤、嘧啶、氨基酸、維生素n 無(wú)機(jī)因子：K+、Na+、Co+、Zn2+、Cu2+、Mo2+ 一般用玻璃儀器配制n 水細(xì)菌需水量 酵母、霉菌需水量綜合考慮干燥程度、培養(yǎng)料的持水性及環(huán)境因素通風(fēng)加水量一般為培養(yǎng)料的1~ 培養(yǎng)基的選擇① 從微生物的特點(diǎn)來(lái)選擇② 液體和固體培養(yǎng)基選擇③ 從生產(chǎn)實(shí)踐和科學(xué)試驗(yàn)的不同要求選擇④ 從經(jīng)濟(jì)效益方面考慮選擇生產(chǎn)原料 培養(yǎng)基成分配比的選擇① 參照前人所使用的較適合于某一類菌種培養(yǎng)基的經(jīng)驗(yàn)配方，② 結(jié)合所用菌種和產(chǎn)品的特性，③ 采用搖瓶、玻璃瓶等小型發(fā)酵設(shè)備，對(duì)碳、氮、無(wú)機(jī)鹽和前體等進(jìn)行逐個(gè)單因子試驗(yàn)，④ 觀察這些因子對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成量的影響，⑤ 綜合考慮各因素的影響，⑥ 得到一個(gè)適合該菌種的培養(yǎng)基配方，⑦ 以得到高產(chǎn)。液體培養(yǎng)法將微生物菌種接種到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。多用10－100－1000噸的發(fā)酵容器進(jìn)行培養(yǎng)。三、 厭氧培養(yǎng)技術(shù)（一）原理厭氣性微生物如梭菌和產(chǎn)甲烷細(xì)菌等，都屬于無(wú)氧呼吸的類型，細(xì)胞具有脫氫酶系，缺乏氧化酶系。這是厭氧菌微生物學(xué)發(fā)展歷史上的一項(xiàng)具有劃時(shí)代意義的創(chuàng)造，由此推動(dòng)了嚴(yán)格厭氧菌（如瘤胃微生物區(qū)系和產(chǎn)甲烷細(xì)菌）的分離和研究。 通過(guò)兩個(gè)塑料手套可對(duì)箱內(nèi)進(jìn)行種種操作，此外箱內(nèi)還設(shè)有恒溫培養(yǎng)箱，以隨時(shí)進(jìn)行厭氧菌的培養(yǎng)。三、菌種保藏（一）菌種保藏的目的按人們的不同要求，把從自然界分離到的野生型，或經(jīng)過(guò)人工選育得到的變異型微生物純種，使其存活，不丟失、不混亂、不污染、不發(fā)生或少發(fā)生變異，保持其優(yōu)良性狀或生理特性，使其處于休眠狀態(tài)（一般使用多種方法保存）。2. 菌種保藏方法（1）暫時(shí)保存（斜面?zhèn)鞔２胤?）最常用的微生物菌種保藏方法，作為菌種的暫時(shí)保藏之用。c) 必須直立放置低溫（5℃左右）干燥處，不便攜帶。干法接種——用接種環(huán)或接種鏟將斜面上生長(zhǎng)好的培養(yǎng)物接種于砂土管，攪拌均勻。④ 投資費(fèi)用較大，并要一個(gè)可靠的氮源。甘油一般以兩倍最終所需濃度的水溶液保存，然后與同等量的細(xì)胞懸液混合。將控溫系統(tǒng)先預(yù)冷到4℃，再將鋁夾放入其中。（七）菌種保藏機(jī)構(gòu)1. 保藏對(duì)象：① 各種微生物（病毒）；② 細(xì)胞系（動(dòng)物或植物）；③ 雜交瘤；④ 體外質(zhì)粒；⑤ 植物組織培養(yǎng)物 2. 保藏機(jī)構(gòu)：① 世界培養(yǎng)物保藏組織（不保藏菌種，只保存資料）② 中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)國(guó)內(nèi)1）普通微生物菌種保藏中心：中科院武漢病毒