【正文】 要用非腐蝕性的消毒劑（如Virkon）清洗干凈，以備下次使用。⑦ 通過緩慢加速把離心機的速度提升到工作速度。⑥ 將樣品管放入離心機中。或者可以使用同一量程。③ 使用中保持轉(zhuǎn)子平衡至關(guān)重要。 尤其注意確保頭發(fā)及衣服遠離旋轉(zhuǎn)部件。 離心機通常有一個安全鎖，以確保機蓋蓋上時電機才轉(zhuǎn)動，同時阻止在轉(zhuǎn)子停止運轉(zhuǎn)之前打開機蓋。 離心機使用的安全措施由于離心機的高速旋轉(zhuǎn)并由此產(chǎn)生極大的力，如使用方法不正確，可能造成極其危險的隱患。對于放射性樣品，即使是低速離心也一定要蓋管帽，并且要使用與所用離心管配套的管帽。g. 能否刺穿。纖維素酯管不可高壓滅菌。玻璃管是惰性物質(zhì)，聚碳酸酯管對有機溶劑（如乙醇、丙酮）敏感，而聚丙烯具有更好的耐腐蝕性。c. 最大離心力。由樣品的體積決定。把平衡好的試管成對放在相對的位置上。167。這種轉(zhuǎn)子在沉淀沒有形成之前不能用來收集懸浮液中的顆粒。同時，減速過程中產(chǎn)生的對流會引起沉淀物的重新懸浮。一般情況下超速離心機要有專門的管理人員操作。通常要在有人直接監(jiān)控下使用。 （4）高速離心機高速離心機通常為較大的立式儀器。常用于短時間內(nèi)（ min）對大顆粒沉淀（如細胞、沉淀物）、小體積溶液（ mL）的沉降。常用于收集細胞、較大的細胞器（如細胞核、葉綠體）及粗粒沉淀（如抗體抗原復合物）。使用硅酮油——硅酮油的密度對溫度敏感，因而操作時要處在一個已知溫度的恒溫環(huán)境，否則將會失敗。另一種方法可將試管刺穿，將內(nèi)容物分段逐滴收集到幾個管中。幾種物質(zhì)可通過離心法形成密度梯度（如蔗糖、葡萄糖、菲可、珀可、尼可登）。（2）密度梯度離心法密度梯度——離心管中的溶液從管頂?shù)焦艿酌芏戎饾u增加。② 低速離心后，沉淀主要由最大的顆粒組成。RCF取決于轉(zhuǎn)子（n，以每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)計r/min）和旋轉(zhuǎn)半徑（r，以mm計），可用公式表示如下：RCF＝ r （n/1000）178。（七）菌種保藏機構(gòu)1. 保藏對象：① 各種微生物（病毒）；② 細胞系（動物或植物）；③ 雜交瘤；④ 體外質(zhì)粒；⑤ 植物組織培養(yǎng)物 2. 保藏機構(gòu)：① 世界培養(yǎng)物保藏組織（不保藏菌種，只保存資料）② 中國微生物菌種保藏管理委員會國內(nèi)1）普通微生物菌種保藏中心：中科院武漢病毒所2）農(nóng)業(yè)微生物保藏管理中心：中國農(nóng)科院3）工業(yè)微生物保藏管理中心：輕工部食品發(fā)酵研究所4）醫(yī)藥微生物保藏管理中心：a. 細菌：衛(wèi)生部b. 真菌：中國醫(yī)科院皮膚病研究所（南京）c. 病毒：中國醫(yī)科院病毒所d. 新抗生素：四川抗生素工業(yè)研究所e. 生產(chǎn)用抗生素：華北制藥廠5）獸醫(yī)微生物保藏管理中心：農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)微生物研究所6）CCTCC: Chinese Centre for Type Cultures Collections, Wuhan University, Wuhan, Hubei, 430072, China.國外1） 美國典型菌種收藏館（ATCC）不承擔鑒定業(yè)務(wù)，工業(yè)菌種收費保藏，教學科研菌種免費供應 2）美國農(nóng)業(yè)研究服務(wù)處菌種收藏館3）英國國立標準菌種貯藏所：不收集不能形成凍干保存的菌種4）法國巴斯德研究所：教學科研免費5）德國微生物和細胞收藏所6）日本微生物菌種保藏聯(lián)合會（JFCC） 第三章 微生物研究中物理化學方法基礎(chǔ)第一節(jié) 離心、電泳原理和方法沉降系數(shù)、梯度離心、泳動度、影響電泳的條件，電泳分類，應用一、 離心技術(shù)（固液分離及不同密度液體分離）原理利用高度旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力分離、純化制備實驗材料，并研究其生物學活性的實驗方法 a) 離心機是一種通過使樣品繞離心轉(zhuǎn)軸的中心旋轉(zhuǎn)而在其上產(chǎn)生一個遠大于地球重力的離心力的機器。,等完全解凍后，再及時轉(zhuǎn)接到合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將控溫系統(tǒng)先預冷到4℃，再將鋁夾放入其中。無菌的二甲基亞砜以1015ml裝量28℃避光保存。甘油一般以兩倍最終所需濃度的水溶液保存，然后與同等量的細胞懸液混合。容器的滅菌：先用蒸餾水漂洗干凈安培瓶，再用蒸餾水在滅菌鍋中121℃浸泡滅菌15分鐘，干燥并將打印好的標簽放入安培瓶中，略擰緊螺旋蓋，再行121℃滅菌30分鐘。④ 投資費用較大，并要一個可靠的氮源。D. 冷凍真空干燥保藏法首先把加一定保護劑的菌懸液冷凍，然后在凍結(jié)狀態(tài)下真空干燥，使微生物細胞處于半永久的休眠狀態(tài)，從而達到長久保藏的目的。干法接種——用接種環(huán)或接種鏟將斜面上生長好的培養(yǎng)物接種于砂土管，攪拌均勻。B. 載體保藏法把微生物附著在合適的載體（沙、土等）上，置干燥處進行保藏。c) 必須直立放置低溫（5℃左右）干燥處，不便攜帶。缺點：保藏時間短；由于傳代頻繁，易引起菌種的變異和退化；易污染；工作量大等（2）長久保存運用干燥、低溫、和隔絕空氣等手段，降低微生物菌種的新陳代謝速率使菌種的生命活動處于半永久性的休眠狀態(tài)，以達到長久保藏的目的。2. 菌種保藏方法（1）暫時保存（斜面?zhèn)鞔２胤?）最常用的微生物菌種保藏方法，作為菌種的暫時保藏之用。l 保藏時，一般利用菌種的休眠體（孢子、芽胞等），創(chuàng)造最有利于休眠狀態(tài)的環(huán)境條件，如低溫、干燥、隔絕空氣或氧氣、缺乏營養(yǎng)物質(zhì)等，使菌體的代謝活性處于最低狀態(tài)，同時也應考慮到經(jīng)濟、簡便方法。三、菌種保藏（一）菌種保藏的目的按人們的不同要求，把從自然界分離到的野生型，或經(jīng)過人工選育得到的變異型微生物純種，使其存活，不丟失、不混亂、不污染、不發(fā)生或少發(fā)生變異，保持其優(yōu)良性狀或生理特性，使其處于休眠狀態(tài)（一般使用多種方法保存）。c) 這種細胞處于休眠狀態(tài)，不進行生長繁殖，但仍含有各種酶系桶，具有氧化和發(fā)酵的能力。 通過兩個塑料手套可對箱內(nèi)進行種種操作，此外箱內(nèi)還設(shè)有恒溫培養(yǎng)箱，以隨時進行厭氧菌的培養(yǎng)。（3）觀察按Hungate厭氧操作法，用彎頭毛細管取長有菌落的瓊脂，加到新的無菌厭氧培養(yǎng)基（液體）厭氧管中培養(yǎng)，鏡檢，測代謝產(chǎn)物，直到獲純菌落。這是厭氧菌微生物學發(fā)展歷史上的一項具有劃時代意義的創(chuàng)造，由此推動了嚴格厭氧菌（如瘤胃微生物區(qū)系和產(chǎn)甲烷細菌）的分離和研究。培養(yǎng)厭氣性微生物時必須防止氧氣侵入培養(yǎng)物或?qū)⑴囵B(yǎng)容器內(nèi)的氧氣除去，充以惰性氣體（如CONH2等）。三、 厭氧培養(yǎng)技術(shù)（一）原理厭氣性微生物如梭菌和產(chǎn)甲烷細菌等，都屬于無氧呼吸的類型，細胞具有脫氫酶系，缺乏氧化酶系。b) 溫度控制培養(yǎng)基滅菌后，冷卻至培養(yǎng)溫度進行種子培養(yǎng)，由于隨著微生物生長和繁殖會產(chǎn)生熱量，攪拌也會產(chǎn)熱，所以要維持溫度恒定，需在夾套中或盤管中通冷卻水循環(huán)。多用10－100－1000噸的發(fā)酵容器進行培養(yǎng)。II. 振蕩培養(yǎng)接種后利用搖床進行振蕩培養(yǎng)，使之通氣良好，增加液體培養(yǎng)基中的溶解氧。液體培養(yǎng)法將微生物菌種接種到液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。⑩ 在培養(yǎng)溫度下將培養(yǎng)基放置24小時，若長菌說明培養(yǎng)基未滅好。 培養(yǎng)基的類型和用途根據(jù)來源分：天然培養(yǎng)基馬鈴薯合成培養(yǎng)基無氮培養(yǎng)基半合成培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基根據(jù)狀態(tài)分固體培養(yǎng)基適于微生物的保存、計數(shù)、純化、分離液體培養(yǎng)基適于觀察微生物生長代謝半固體培養(yǎng)基（~%）適于觀察細菌的運動性③ 根據(jù)主要成分或使用目的分：A. 基礎(chǔ)培養(yǎng)基B. 增殖培養(yǎng)基C. 鑒別培養(yǎng)基（eg.：乳糖培養(yǎng)基，應用于水質(zhì)檢測）D. 選擇培養(yǎng)基（在培養(yǎng)基中添加某些物質(zhì)使特定微生物得以生長而其它不生長eg.：無氮培養(yǎng)基、抗生素培養(yǎng)基）無機鹽培養(yǎng)基：培養(yǎng)自養(yǎng)微生物，eg.：硅膠平板④ 根據(jù)生產(chǎn)工業(yè)的要求分：孢子培養(yǎng)基——供制備孢子用；種子培養(yǎng)基——滿足菌種生長；發(fā)酵培養(yǎng)基——滿足大生產(chǎn)中大量菌體生長和繁殖以及代謝產(chǎn)物積累⑤ 無機鹽培養(yǎng)基：培養(yǎng)自養(yǎng)微生物，eg.：硅膠平板⑥ 活組織培養(yǎng)基：雞胚、單層細胞、昆蟲、高等動物，用于培養(yǎng)病毒、立克次氏體等專性寄生微生物 成分n 能源：有機能、無機鹽、光源n 碳源：作為細胞骨架n 氮源：合成蛋白質(zhì)n 生長因子：嘌呤、嘧啶、氨基酸、維生素n 無機因子：K+、Na+、Co+、Zn2+、Cu2+、Mo2+ 一般用玻璃儀器配制n 水細菌需水量 酵母、霉菌需水量綜合考慮干燥程度、培養(yǎng)料的持水性及環(huán)境因素通風加水量一般為培養(yǎng)料的1~ 培養(yǎng)基的選擇① 從微生物的特點來選擇② 液體和固體培養(yǎng)基選擇③ 從生產(chǎn)實踐和科學試驗的不同要求選擇④ 從經(jīng)濟效益方面考慮選擇生產(chǎn)原料 培養(yǎng)基成分配比的選擇① 參照前人所使用的較適合于某一類菌種培養(yǎng)基的經(jīng)驗配方，② 結(jié)合所用菌種和產(chǎn)品的特性，③ 采用搖瓶、玻璃瓶等小型發(fā)酵設(shè)備，對碳、氮、無機鹽和前體等進行逐個單因子試驗，④ 觀察這些因子對菌體生長和產(chǎn)物合成量的影響，⑤ 綜合考慮各因素的影響，⑥ 得到一個適合該菌種的培養(yǎng)基配方，⑦ 以得到高產(chǎn)。若多種微生物在一起但比較嬌弱，則不適于熱處理，在這種情況下，尤其是多種微生物性質(zhì)相似、難以分開時，可在顯微鏡下利用毛細管吸單個菌。真空中，水60℃蒸發(fā)，記錄體積。若污染嚴重可加15%重鉻酸鉀。化學藥劑適用于生產(chǎn)車間環(huán)境的滅菌，接種操作前小型器具的滅菌等。從事微生物學工作，必須采用特殊的裝置，這就是我們通常所用的高壓蒸汽滅菌法，它能達到完全滅菌的目的。 超聲波、微波 （均勻、快速） 濕熱滅菌法：最常使用又最簡單的物理方法是加熱滅菌。紫外線對芽胞和營養(yǎng)細胞都能起作用，但細菌芽胞和霉菌孢子對紫外線的抵抗力強。 實際應用時，對一些要求保持干燥的實驗器具和材料可以采用干熱滅菌法。要點： 1. 滅菌：利用物理、化學方法殺死物體表面、內(nèi)部全部的微生物。 ⑥ 高醇度：用白酒或黃酒保存食品，在我國有悠久傳統(tǒng)，如：醉蟹、醉麩、醉筍和黃泥螺等產(chǎn)品，都是特色風味食品。除氧劑的種類很多，是由主要原料鐵粉再加上一定量的輔料和填充劑制成，對糕點等含水量較高的新鮮食品有良好的保鮮功能。例如：常用的對皮膚、水果、飲用水進行藥劑消毒的方法對啤酒、牛奶、果汁和醬油等進行消毒處理的巴氏消毒法1） 巴氏消毒法（pasteurization）2）煮沸消毒法采用在100℃下煮沸數(shù)分鐘的方法，一般用于飲用水的消毒。第一章 緒論課程主要內(nèi)容：微生物學研究技術(shù)發(fā)展微生物材料的準備微生物研究中的物理化學方法基礎(chǔ)微生物的觀察與微生物分析法細胞破碎方法及亞細胞物質(zhì)分離微生物育種技術(shù)固相化技術(shù)與生物傳感器免疫學技術(shù)微生物學研究的分子生物學技術(shù) 微生物學研究技術(shù)發(fā)展：微生物學是整個生物學中第一門具有一套自己獨特操作技術(shù)的學科，其技術(shù)的發(fā)展主要包括：顯微鏡術(shù)和制片染色技術(shù)消毒滅菌技術(shù)和無菌操作技術(shù)純種分離和克隆化技術(shù)合成培養(yǎng)基技術(shù)；選擇性和鑒別性培養(yǎng)技術(shù)突變型標記和篩選技術(shù)；深層液體培養(yǎng)技術(shù)菌種保藏技術(shù)原生質(zhì)體制備和融合技術(shù)各種DNA重組技術(shù)等 第二章 微生物材料的準備第一節(jié) 滅菌、消毒、除菌與無菌操作掌握知識要點：原理、方法、生物活性物質(zhì)的除菌無菌操作：意識、個人衛(wèi)生、環(huán)境衛(wèi)生、滅菌、接種等操作、保存一、 幾個基本概念控制害菌的措施：1）殺滅法： 滅菌：徹底殺滅（殺菌、溶菌）——一切微生物 消毒：部分殺滅——僅殺滅病原菌2）抑制法： 防腐：抑制霉腐微生物 化療：抑制宿主體內(nèi)的病原菌 滅菌：采用強烈的理化因素使任何物體內(nèi)外部的一切微生物永遠喪失其生長繁殖能力的措施。一種采用較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體或動、植物有害的病原菌，而對被消毒的對象基本無害的措施。② 缺氧：可采用抽真空、充氮或二氧化碳、加入除氧劑等方法來有效防止食品和糧食等的霉腐、變質(zhì)而達到保鮮的目的。 ⑤ 高酸度：在我國和韓國等具有悠久歷史的泡菜，就是利用乳酸菌的厭氧發(fā)酵使新鮮蔬菜產(chǎn)生大量乳酸，借這種高酸度而達到抑制雜菌和防霉腐的目的。用于化學治療目的的化學物質(zhì)稱化學治療劑，包括磺胺類等化學合成藥物、抗生素、生物藥物素和若干中草藥中有效成分等。滅菌、消毒、防腐、化療的比較比較項目滅菌消毒防腐化療處理因素強理、化因素理化因素理化因素化學治療劑處理對象任何物體內(nèi)外生物體表，酒、乳等有機質(zhì)物體內(nèi)外宿主體內(nèi)微生物類型一切微生物有關(guān)病原菌一切微生物有關(guān)病原菌對微生物作用徹底殺死殺死或抑制抑制或殺死抑制或殺死實例加壓蒸汽滅菌，輻射滅菌，化學殺菌劑70％酒精消毒，巴氏消毒法冷藏，干燥，糖漬，鹽腌，缺氧，化學防腐劑抗生素，磺胺藥，生物藥物素二、 滅菌的方法 干熱滅菌法: 干熱滅菌所需的溫度要高，時間要長，一般160～170℃、2h，到達160 ℃之后開始計時。 電磁波、射線滅菌法：利用電磁波、紫外線、X射線、γ射線或放射性物質(zhì)產(chǎn)生的高能粒子進行滅菌，以紫外線最常用。除紫外線外，X射線和γ射線也可進行滅菌。家用高壓蒸汽鍋內(nèi)的溫度可以接近這個溫度。以殺滅嗜熱脂肪芽胞桿菌（121℃，10min）為依據(jù)（2）高壓蒸汽滅菌鍋的種類臥式、手提式、立式（3）濕熱滅菌出現(xiàn)的問題I. 培養(yǎng)基發(fā)生渾濁或沉淀a. 蛋白質(zhì)大分子凝固b. 鈣、鎂等的二、三價離子與可溶性磷酸鹽形成沉淀 措施：分開滅菌II. 改變和破壞營養(yǎng)成分糖在加熱條件下產(chǎn)生褐色物質(zhì)冷凝水使體積增加酸性條件下滅菌更徹底，只需要煮沸5min措施：葡萄糖滅菌115℃，20—30min（4）間歇滅菌適用于蛋清、牛乳等不耐熱的培養(yǎng)基方法：60—70℃滅菌30min→37 ℃培養(yǎng)過夜→反復5—6次 化學藥劑滅菌法某些化學藥劑能與微生物發(fā)生反應而具有殺菌的作用。① 甲醛（一般不單獨使用）