【正文】 血漿中氨基酸濃度，而且，進(jìn)行血漿氨基酸濃度分析有許多困難。 ? 如果單個(gè)氨基酸的消化率和總的蛋白質(zhì)消化率之間有密切的相關(guān)，那么通過(guò)氮消化率的測(cè)量對(duì)氨基酸利用率進(jìn)行預(yù)測(cè)，為間接體內(nèi)法提供了方便的途徑。在一些實(shí)驗(yàn)中，曾報(bào)道過(guò)某些氨基酸的利用率與氮消化率之間存在一定的相關(guān)，但這種方法仍有局限性。 ? 直接體內(nèi)法 ? 由于直接測(cè)定氨基酸的利用率存在許多技術(shù)上的難題，就轉(zhuǎn)而用氨基酸的消化率來(lái)評(píng)價(jià)氨基酸利用率。飼料中的每種氨基酸都有四種可能的值來(lái)表示其消化率：即糞和回盲腸的表觀消化率和真消化率。 ? （ 1）豬回腸氨基酸消化率的測(cè)定。由于大腸微生物干擾較大，使測(cè)定值偏高（約10％），故均采用回腸末端收取食糜的方法，測(cè)定回腸氨基酸消化率。由于從消化道后段排出的氨基酸對(duì)機(jī)體沒(méi)有價(jià)值（ Rerat， 1978），故必須測(cè)定來(lái)自回腸的氨基酸。這就需要在氨基酸流入結(jié)腸時(shí)，用外科瘺管來(lái)收集所有的消化液或是消化液樣品。采用這種方法要在回腸后段安裝一個(gè)瘺管，另一個(gè)瘺管安在回腸末端收集已測(cè)量好的回流的消化液樣品。使用的瘺管有凹型和 T型兩種，凹型瘺管能準(zhǔn)確測(cè)定消化液的流出量，但是，胃腸道的破壞會(huì)影響到小腸的功能。使用 T型瘺管時(shí)，在食糜離開回腸時(shí)收集消化液樣品，根本不會(huì)損壞腸道，然而， T型瘺管需要一個(gè)標(biāo)記來(lái)測(cè)定流出量。 ? 安裝瘺管的動(dòng)物限制在籠子里，一天 24h進(jìn)行收集，從 30min到 120min不等，收集到的消化液樣品測(cè)出總的排泄量。取完樣品后，剩余的從末端瘺管流回豬體內(nèi)，比較回腸氨基酸流出量和日糧氨基酸攝入量可計(jì)算出表觀回腸消化率。這種方法是可行的和有用的，因?yàn)樗@示出了動(dòng)物最小的氨基酸凈損失量。 ? 表觀消化率經(jīng)過(guò)內(nèi)源損失修正后，得到的真消化率結(jié)果更準(zhǔn)確，改進(jìn)程度視日糧攝入的氨基酸量而定。但是把蛋白質(zhì)水平從 10％提高到 20％對(duì)表觀回腸消化率無(wú)影響。實(shí)際上大多數(shù)研究已把表觀回腸消化率作為飼料氨基酸利用率的指標(biāo)。 ? 通過(guò)外科手術(shù)收集回腸末端食糜的主要方法有： T型管、橋式瘺管、回 直腸接合技術(shù)、可移動(dòng)（可操縱）的回盲瘺手術(shù)。每種方法的測(cè)值并無(wú)太大的差異，加上氨基酸分析測(cè)定的誤差本身較大，所以很難說(shuō)哪一個(gè)方法測(cè)值最準(zhǔn)確。目前主要是看哪種方法最簡(jiǎn)便，包括取樣程序和對(duì)荷術(shù)豬的影響。相對(duì)說(shuō)來(lái)，回 直腸吻合術(shù)還較可取，雖手術(shù)麻煩，但糞樣（食糜）收集簡(jiǎn)單，而且可做到樣品有代表性。 ? （ 2）禽類氨基酸消化率的測(cè)定。禽飼料氨基酸消化率的測(cè)定相對(duì)較簡(jiǎn)單，因禽大腸較短，而且主要是盲腸，所以不必安裝瘺管。安裝也困難。為減少盲腸的影響，可切除盲腸。關(guān)于切不切除盲腸現(xiàn)有爭(zhēng)議，大多數(shù)飼料切除盲腸與否對(duì)氨基酸消化率無(wú)顯著影響，只少數(shù)飼料如肉骨粉等，切除盲腸后氨基酸消化率降低。另一些人認(rèn)為盲腸在氮代謝中對(duì)尿中尿酸的二次利用有重要作用，未經(jīng)小腸吸收的氨基酸和短肽也可為盲腸微生物充分利用，因此不宜切除。 ? 氨基酸分析儀的測(cè)定值誤差較大，必然會(huì)影響到飼料氨基酸的消化率測(cè)值的準(zhǔn)確性，一次試驗(yàn)測(cè)得的值很難說(shuō)準(zhǔn)確、可靠，一般取平均值較合理。 ? 前面所述方法測(cè)定的飼料氨基酸消化率都是指表觀消化率。收集的回腸末端食糜或糞樣中的氨基酸實(shí)際上包括了兩個(gè)部分，即飼料中未被消化吸收的殘余和整個(gè)消化道的分泌物、細(xì)胞脫落物等內(nèi)源性的氨基酸等。因此，為了準(zhǔn)確測(cè)定飼料氨基酸的真消化率，就必須正確評(píng)估動(dòng)物的內(nèi)源性氨基酸排泄量。評(píng)價(jià)方法主要有： ? （ 1）無(wú)氮日糧法和回歸外推法。 ? （ 2）酶解酪蛋白 /超濾法。 ? （ 3） 15N同位素標(biāo)記法。 ? （ 4）高精氨酸法。 ? （ 1）無(wú)氮日糧法和回歸外推法。測(cè)定飼料氨基酸真消化率的最為經(jīng)典的方法是Mitchell（ 1924）建立的無(wú)蛋白質(zhì)（氮）日糧法。其假定條件是動(dòng)物采食不含任何蛋白質(zhì)的日糧后，進(jìn)入食糜或糞中的蛋白質(zhì)、氨基酸即為內(nèi)源性的，并且在不同日糧條件下動(dòng)物內(nèi)源性氨基酸的排泄量和氨基酸組成是相同或相似的。然而事實(shí)上并非如此，隨著動(dòng)物采食蛋白質(zhì)量的增加，其內(nèi)源性氨基酸的排泄亦相應(yīng)增加。 Low（ 1979）指出，動(dòng)物在采食無(wú)氮日糧后，改變了動(dòng)物的代謝而影響內(nèi)源性氨基酸的排泄量。 Ozimek等（ 1985）發(fā)現(xiàn)動(dòng)物采食無(wú)氮日糧后，胰腺分泌的消化酶減少，分泌的蛋白質(zhì)量亦減少。由于無(wú)氮日糧影響動(dòng)物消化道的分泌和吸收功能，一般認(rèn)為無(wú)氮日糧法低估了豬的內(nèi)源性氨基酸排泄量，即高估了飼料的氨基酸真消化率。 ? （ 2）酶解酪蛋白 /超濾法。 Moughan等（ 1990）針對(duì)上述問(wèn)題，提出了一種酶解酪蛋白 /超濾的新方法來(lái)估測(cè)動(dòng)物的內(nèi)源性氨基酸排泄。其技術(shù)原理和過(guò)程如下：給動(dòng)物飼喂含酶解酪蛋白（分子質(zhì)量低于 1021g）的半純合日糧，然后收集回腸末端食糜，立即通過(guò)離心和超濾等方法，將食糜中的大分子蛋白質(zhì)（分子質(zhì)量大于 1020g）與小分子蛋白質(zhì)（分子質(zhì)量小于 1020g）迅速分離開來(lái)，大分子量蛋白質(zhì)即為內(nèi)源性的，而小分子量蛋白質(zhì)是飼糧中未被吸收的部分。當(dāng)然內(nèi)源性蛋白質(zhì)也有可能被水解為小分子蛋白質(zhì)，但所占比例很小，可以忽略不計(jì)。 Butts等（ 1991）將該方法應(yīng)用于生長(zhǎng)大鼠的內(nèi)源性氨基酸排泄的測(cè)定，其測(cè)定值高于無(wú)氮日糧法，而與 15N同位素標(biāo)記法的結(jié)果相當(dāng)。說(shuō)明該方法在評(píng)估動(dòng)物內(nèi)源性氨基酸排泄上有相當(dāng)?shù)臏?zhǔn)確性。 Yin和 Mccracken（ 1996）認(rèn)為，盡管此方法還未見(jiàn)有直接測(cè)定豬內(nèi)源性氨基酸排泄的報(bào)道，但仍不失一種較為有應(yīng)用價(jià)值的試驗(yàn)方法。 ? （ 3） 15N同位素標(biāo)記法。目前認(rèn)為 15N同位素標(biāo)記技術(shù)是直接測(cè)定內(nèi)源性氨基酸排泄最有效的方法，而且可用于測(cè)定日糧成分變化對(duì)內(nèi)源性氨基酸排泄的影響。 15N同位素標(biāo)記方法可通過(guò)兩種途徑進(jìn)行，一是對(duì)飼料蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記；二是對(duì)動(dòng)物的氨基酸庫(kù)即內(nèi)源性氨基酸進(jìn)行標(biāo)記。 15N同位素標(biāo)記的飼料非常昂貴而且不易得到，因而限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。這樣，大多利用各種不同的 15N同位素標(biāo)記動(dòng)物的氨基酸庫(kù)，即使用 15N同位素進(jìn)行連續(xù)的靜脈灌注（或稱稀釋），糞中或食糜中內(nèi)源性氨基酸可以通過(guò)同位素的稀釋方法來(lái)計(jì)算。在應(yīng)用 15N同位素稀釋技術(shù)時(shí)，有三個(gè)必須解決的現(xiàn)實(shí)問(wèn)題：一是被標(biāo)記的含氮物的選擇；二是 15N豐度穩(wěn)態(tài)的判斷；三是前體庫(kù)的選擇。最好選擇 15N同位素標(biāo)記的各種氨基酸的混合物作為標(biāo)記。但由于價(jià)格昂貴，實(shí)際應(yīng)用中仍然只選擇一種氨基酸進(jìn)行標(biāo)記。作為標(biāo)記物的氨基酸要具有以下的特點(diǎn)：①可以發(fā)生轉(zhuǎn)氨基作用，使標(biāo)記的同位素轉(zhuǎn)移到其他氨基酸中去。②被標(biāo)記處理后不影響采食量。③被標(biāo)記后不影響氨基酸代謝，不會(huì)導(dǎo)致氨基酸的不平衡。 Grala等（ 1998）經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，唯有亮氨酸完全符合上述條件。因此， 15N標(biāo)記亮氨酸被普遍選作測(cè)定內(nèi)源性氨基酸的標(biāo)記物，其灌注劑量一般為 ～ （ kgd），灌注時(shí)間 8～ 9d以上。在運(yùn)用 15N同位素稀釋技術(shù)時(shí)，采樣時(shí) 15N的豐度應(yīng)當(dāng)達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定狀態(tài)?；啬c末端食糜的內(nèi)源性氨基酸中15N的豐度與血清三氯乙酸（ TCA）可溶部分中的 15N豐度是相似的。但是血清總氮 TCA可溶部分中 15N豐度存在晝夜變化。 Schulze（ 1994）指出， 15N灌注 5～ 8d后，并在兩次飼喂的中間采血， 15N豐度的穩(wěn)定狀態(tài)基本可以達(dá)到。內(nèi)源性氨基酸的前體庫(kù)包括所有代謝組織，而且主要是全身肌肉組織。因此必須選擇一個(gè)與15N的親和力相似的參照物，來(lái)代替前體組織的 15N豐度。而這種參照物中 15N豐度也可代表回腸末端食糜中內(nèi)源性氨基酸的 15N豐度。血清往往是最理想的參照物。 ? （ 4）高精氨酸法。如前所述， 15N同位素標(biāo)記技術(shù)是對(duì)內(nèi)源性氮前體庫(kù)進(jìn)行標(biāo)記的，以此為基礎(chǔ)區(qū)分回腸食糜中內(nèi)源性氮與飼料中的氮。 Souffrant（ 1991）、 Schultz等（ 1991）和Nyachoti等（ 1997）提出了用高精氨酸標(biāo)記日糧蛋白質(zhì)中賴氨酸的方法，測(cè)定內(nèi)源性氮的排泄。其工作原理是：在一定條件下將飼料蛋白質(zhì)中的賴氨酸與甲基異脲反應(yīng)，生成高精氨酸，當(dāng)高精氨酸被吸收后，在肝臟精氨酸酶的作用下，又可很快轉(zhuǎn)變?yōu)橘嚢彼?，同時(shí)釋放出尿素。高精氨酸不構(gòu)成內(nèi)源性氮，所以消化道脫離細(xì)胞以及分泌的消化液中不含高精氨酸，回腸食糜中高精氨酸即為飼料中未被消化吸收的外源蛋白質(zhì)。動(dòng)物對(duì)胍基化日糧蛋白質(zhì)和天然蛋白質(zhì)具有相同的蛋白酶分解和吸收能力。 Souffrant（ 1991）的研究表明，豬對(duì)高精氨酸標(biāo)記過(guò)的酪蛋白和大豆分離蛋白的回腸吸收率高達(dá) 97％，且只有微量（＜ ％）的高精氨酸由血液進(jìn)入腸腔。 Schulze等（ 1994）指出，高精氨酸法必須使經(jīng)胍基化的高精氨酸在待測(cè)飼料蛋白質(zhì)中均勻分布，才能有代表性，否則影響測(cè)定結(jié)果。如果飼料蛋白質(zhì)中的賴氨酸側(cè)鏈被封閉，特別是經(jīng)邁拉德反應(yīng)后封閉時(shí)，賴氨酸側(cè)鏈就不能與甲基異脲反應(yīng)而轉(zhuǎn)化成高精氨酸。這樣受熱損害的飼料蛋白質(zhì)經(jīng)胍基化后的代表性差，從而導(dǎo)致對(duì)內(nèi)源性氮的估測(cè)誤差。 瘤胃降解蛋白和瘤胃未降解蛋白 ? 反芻動(dòng)物的日糧蛋白（氮）可以根據(jù)其在瘤胃的可降解性分為快速可降解部分、可降解部分和不可降解部分。 瘤胃降解和小腸消化的日糧氮組分 組分 主要化合物 瘤胃降解 /(%/h) 腸道消化率 /% A 氨、硝酸鹽、氨基酸、肽 持續(xù)不斷 不會(huì)到達(dá)腸道 B1 球蛋白、某些清蛋白 200～ 300 100 B2 大多數(shù)清蛋白、面筋蛋白 5～ 15 100 B3 細(xì)胞壁蛋白、變性蛋白、醇溶谷蛋白 ～ C 邁拉德反應(yīng)產(chǎn)物、與木質(zhì)素連接的氮、單寧結(jié)合蛋白 0 0 降解率的體內(nèi)測(cè)定 ? 體內(nèi)測(cè)定降解率需測(cè)定日糧攝入氮（ FIN）、內(nèi)源氮（ EN），通過(guò)十二指腸中來(lái)源于日糧的非氨態(tài)氮（ NAN），和微生物氮（ MIN）。這樣日糧氮的降解率（ Dy）可以用下面的公式表示： ? Dy=1[NAN（ MIN+EN） ]/FIN ? 這一方法需準(zhǔn)確測(cè)定十二指腸的食糜流量、微生物氮和內(nèi)源氮含量，這些參數(shù)的測(cè)定需使用雙指示劑和同位素標(biāo)記技術(shù)，會(huì)使測(cè)定結(jié)果有較大誤差。內(nèi)源氮含量隨動(dòng)物種類和飼養(yǎng)水平不同有一定差異，約占 ％～ ％，常用 ％作為估計(jì)值。盡管這一方法不十分準(zhǔn)確，但是它是目前測(cè)定氮降解率絕對(duì)值的唯一可用方法，且用作檢驗(yàn)其他測(cè)定方法準(zhǔn)確性的標(biāo)準(zhǔn)。 瘤胃尼龍袋法測(cè)定氮降解率 ? 將飼料裝入一個(gè)人造纖維袋，然后將袋懸于瘤胃內(nèi)。經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，比較放入瘤胃前后的氮含量變化。 ? 降解率（ %） =（放入瘤胃前氮含量－從瘤胃取出后氮含量） /放入瘤胃前氮含量 ? 由于纖維袋中的蛋白質(zhì)消失率與時(shí)間相關(guān)，并隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，增加的幅度變小。該測(cè)定方法也有許多導(dǎo)致分析誤差的因素，如樣品大小、纖維袋大小、纖維材料的多孔性、袋從瘤胃取出以后的處理等。 ? ARC（ 1992）提出了該測(cè)定方法的技術(shù)規(guī)程。這一方法假設(shè)纖維袋中的氮消失率能夠反映飼料氮在瘤胃液中的溶解性，即降解率。但事實(shí)上，有時(shí)飼料蛋白溶解后并沒(méi)有降解就離開了瘤胃，而且最近發(fā)現(xiàn)不可降解的飼料酸性洗滌不溶性氮（ ADIN），可以在瘤胃孵育過(guò)程中消失，另外瘤胃細(xì)菌進(jìn)入纖維袋中，從而增加未降解氮的含量。