【正文】 血漿中氨基酸濃度，而且，進行血漿氨基酸濃度分析有許多困難。 ? 如果單個氨基酸的消化率和總的蛋白質(zhì)消化率之間有密切的相關(guān)，那么通過氮消化率的測量對氨基酸利用率進行預(yù)測，為間接體內(nèi)法提供了方便的途徑。在一些實驗中，曾報道過某些氨基酸的利用率與氮消化率之間存在一定的相關(guān)，但這種方法仍有局限性。 ? 直接體內(nèi)法 ? 由于直接測定氨基酸的利用率存在許多技術(shù)上的難題，就轉(zhuǎn)而用氨基酸的消化率來評價氨基酸利用率。飼料中的每種氨基酸都有四種可能的值來表示其消化率：即糞和回盲腸的表觀消化率和真消化率。 ? （ 1）豬回腸氨基酸消化率的測定。由于大腸微生物干擾較大，使測定值偏高（約10％），故均采用回腸末端收取食糜的方法，測定回腸氨基酸消化率。由于從消化道后段排出的氨基酸對機體沒有價值（ Rerat， 1978），故必須測定來自回腸的氨基酸。這就需要在氨基酸流入結(jié)腸時，用外科瘺管來收集所有的消化液或是消化液樣品。采用這種方法要在回腸后段安裝一個瘺管，另一個瘺管安在回腸末端收集已測量好的回流的消化液樣品。使用的瘺管有凹型和 T型兩種，凹型瘺管能準(zhǔn)確測定消化液的流出量，但是，胃腸道的破壞會影響到小腸的功能。使用 T型瘺管時，在食糜離開回腸時收集消化液樣品，根本不會損壞腸道，然而， T型瘺管需要一個標(biāo)記來測定流出量。 ? 安裝瘺管的動物限制在籠子里，一天 24h進行收集，從 30min到 120min不等，收集到的消化液樣品測出總的排泄量。取完樣品后，剩余的從末端瘺管流回豬體內(nèi)，比較回腸氨基酸流出量和日糧氨基酸攝入量可計算出表觀回腸消化率。這種方法是可行的和有用的，因為它顯示出了動物最小的氨基酸凈損失量。 ? 表觀消化率經(jīng)過內(nèi)源損失修正后，得到的真消化率結(jié)果更準(zhǔn)確，改進程度視日糧攝入的氨基酸量而定。但是把蛋白質(zhì)水平從 10％提高到 20％對表觀回腸消化率無影響。實際上大多數(shù)研究已把表觀回腸消化率作為飼料氨基酸利用率的指標(biāo)。 ? 通過外科手術(shù)收集回腸末端食糜的主要方法有： T型管、橋式瘺管、回 直腸接合技術(shù)、可移動（可操縱）的回盲瘺手術(shù)。每種方法的測值并無太大的差異，加上氨基酸分析測定的誤差本身較大，所以很難說哪一個方法測值最準(zhǔn)確。目前主要是看哪種方法最簡便，包括取樣程序和對荷術(shù)豬的影響。相對說來，回 直腸吻合術(shù)還較可取，雖手術(shù)麻煩，但糞樣（食糜）收集簡單，而且可做到樣品有代表性。 ? （ 2）禽類氨基酸消化率的測定。禽飼料氨基酸消化率的測定相對較簡單，因禽大腸較短，而且主要是盲腸，所以不必安裝瘺管。安裝也困難。為減少盲腸的影響，可切除盲腸。關(guān)于切不切除盲腸現(xiàn)有爭議，大多數(shù)飼料切除盲腸與否對氨基酸消化率無顯著影響，只少數(shù)飼料如肉骨粉等，切除盲腸后氨基酸消化率降低。另一些人認為盲腸在氮代謝中對尿中尿酸的二次利用有重要作用，未經(jīng)小腸吸收的氨基酸和短肽也可為盲腸微生物充分利用，因此不宜切除。 ? 氨基酸分析儀的測定值誤差較大，必然會影響到飼料氨基酸的消化率測值的準(zhǔn)確性，一次試驗測得的值很難說準(zhǔn)確、可靠，一般取平均值較合理。 ? 前面所述方法測定的飼料氨基酸消化率都是指表觀消化率。收集的回腸末端食糜或糞樣中的氨基酸實際上包括了兩個部分，即飼料中未被消化吸收的殘余和整個消化道的分泌物、細胞脫落物等內(nèi)源性的氨基酸等。因此，為了準(zhǔn)確測定飼料氨基酸的真消化率，就必須正確評估動物的內(nèi)源性氨基酸排泄量。評價方法主要有： ? （ 1）無氮日糧法和回歸外推法。 ? （ 2）酶解酪蛋白 /超濾法。 ? （ 3） 15N同位素標(biāo)記法。 ? （ 4）高精氨酸法。 ? （ 1）無氮日糧法和回歸外推法。測定飼料氨基酸真消化率的最為經(jīng)典的方法是Mitchell（ 1924）建立的無蛋白質(zhì)（氮）日糧法。其假定條件是動物采食不含任何蛋白質(zhì)的日糧后，進入食糜或糞中的蛋白質(zhì)、氨基酸即為內(nèi)源性的，并且在不同日糧條件下動物內(nèi)源性氨基酸的排泄量和氨基酸組成是相同或相似的。然而事實上并非如此，隨著動物采食蛋白質(zhì)量的增加，其內(nèi)源性氨基酸的排泄亦相應(yīng)增加。 Low（ 1979）指出，動物在采食無氮日糧后，改變了動物的代謝而影響內(nèi)源性氨基酸的排泄量。 Ozimek等（ 1985）發(fā)現(xiàn)動物采食無氮日糧后，胰腺分泌的消化酶減少，分泌的蛋白質(zhì)量亦減少。由于無氮日糧影響動物消化道的分泌和吸收功能，一般認為無氮日糧法低估了豬的內(nèi)源性氨基酸排泄量，即高估了飼料的氨基酸真消化率。 ? （ 2）酶解酪蛋白 /超濾法。 Moughan等（ 1990）針對上述問題，提出了一種酶解酪蛋白 /超濾的新方法來估測動物的內(nèi)源性氨基酸排泄。其技術(shù)原理和過程如下：給動物飼喂含酶解酪蛋白（分子質(zhì)量低于 1021g）的半純合日糧，然后收集回腸末端食糜，立即通過離心和超濾等方法，將食糜中的大分子蛋白質(zhì)（分子質(zhì)量大于 1020g）與小分子蛋白質(zhì)（分子質(zhì)量小于 1020g）迅速分離開來，大分子量蛋白質(zhì)即為內(nèi)源性的，而小分子量蛋白質(zhì)是飼糧中未被吸收的部分。當(dāng)然內(nèi)源性蛋白質(zhì)也有可能被水解為小分子蛋白質(zhì)，但所占比例很小，可以忽略不計。 Butts等（ 1991）將該方法應(yīng)用于生長大鼠的內(nèi)源性氨基酸排泄的測定，其測定值高于無氮日糧法，而與 15N同位素標(biāo)記法的結(jié)果相當(dāng)。說明該方法在評估動物內(nèi)源性氨基酸排泄上有相當(dāng)?shù)臏?zhǔn)確性。 Yin和 Mccracken（ 1996）認為，盡管此方法還未見有直接測定豬內(nèi)源性氨基酸排泄的報道，但仍不失一種較為有應(yīng)用價值的試驗方法。 ? （ 3） 15N同位素標(biāo)記法。目前認為 15N同位素標(biāo)記技術(shù)是直接測定內(nèi)源性氨基酸排泄最有效的方法，而且可用于測定日糧成分變化對內(nèi)源性氨基酸排泄的影響。 15N同位素標(biāo)記方法可通過兩種途徑進行，一是對飼料蛋白質(zhì)進行標(biāo)記；二是對動物的氨基酸庫即內(nèi)源性氨基酸進行標(biāo)記。 15N同位素標(biāo)記的飼料非常昂貴而且不易得到，因而限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。這樣，大多利用各種不同的 15N同位素標(biāo)記動物的氨基酸庫，即使用 15N同位素進行連續(xù)的靜脈灌注（或稱稀釋），糞中或食糜中內(nèi)源性氨基酸可以通過同位素的稀釋方法來計算。在應(yīng)用 15N同位素稀釋技術(shù)時，有三個必須解決的現(xiàn)實問題：一是被標(biāo)記的含氮物的選擇；二是 15N豐度穩(wěn)態(tài)的判斷；三是前體庫的選擇。最好選擇 15N同位素標(biāo)記的各種氨基酸的混合物作為標(biāo)記。但由于價格昂貴，實際應(yīng)用中仍然只選擇一種氨基酸進行標(biāo)記。作為標(biāo)記物的氨基酸要具有以下的特點：①可以發(fā)生轉(zhuǎn)氨基作用，使標(biāo)記的同位素轉(zhuǎn)移到其他氨基酸中去。②被標(biāo)記處理后不影響采食量。③被標(biāo)記后不影響氨基酸代謝，不會導(dǎo)致氨基酸的不平衡。 Grala等（ 1998）經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，唯有亮氨酸完全符合上述條件。因此， 15N標(biāo)記亮氨酸被普遍選作測定內(nèi)源性氨基酸的標(biāo)記物，其灌注劑量一般為 ～ （ kgd），灌注時間 8～ 9d以上。在運用 15N同位素稀釋技術(shù)時，采樣時 15N的豐度應(yīng)當(dāng)達到一個穩(wěn)定狀態(tài)?；啬c末端食糜的內(nèi)源性氨基酸中15N的豐度與血清三氯乙酸（ TCA）可溶部分中的 15N豐度是相似的。但是血清總氮 TCA可溶部分中 15N豐度存在晝夜變化。 Schulze（ 1994）指出， 15N灌注 5～ 8d后，并在兩次飼喂的中間采血， 15N豐度的穩(wěn)定狀態(tài)基本可以達到。內(nèi)源性氨基酸的前體庫包括所有代謝組織，而且主要是全身肌肉組織。因此必須選擇一個與15N的親和力相似的參照物，來代替前體組織的 15N豐度。而這種參照物中 15N豐度也可代表回腸末端食糜中內(nèi)源性氨基酸的 15N豐度。血清往往是最理想的參照物。 ? （ 4）高精氨酸法。如前所述， 15N同位素標(biāo)記技術(shù)是對內(nèi)源性氮前體庫進行標(biāo)記的，以此為基礎(chǔ)區(qū)分回腸食糜中內(nèi)源性氮與飼料中的氮。 Souffrant（ 1991）、 Schultz等（ 1991）和Nyachoti等（ 1997）提出了用高精氨酸標(biāo)記日糧蛋白質(zhì)中賴氨酸的方法，測定內(nèi)源性氮的排泄。其工作原理是：在一定條件下將飼料蛋白質(zhì)中的賴氨酸與甲基異脲反應(yīng)，生成高精氨酸，當(dāng)高精氨酸被吸收后，在肝臟精氨酸酶的作用下，又可很快轉(zhuǎn)變?yōu)橘嚢彼?，同時釋放出尿素。高精氨酸不構(gòu)成內(nèi)源性氮，所以消化道脫離細胞以及分泌的消化液中不含高精氨酸，回腸食糜中高精氨酸即為飼料中未被消化吸收的外源蛋白質(zhì)。動物對胍基化日糧蛋白質(zhì)和天然蛋白質(zhì)具有相同的蛋白酶分解和吸收能力。 Souffrant（ 1991）的研究表明，豬對高精氨酸標(biāo)記過的酪蛋白和大豆分離蛋白的回腸吸收率高達 97％，且只有微量（＜ ％）的高精氨酸由血液進入腸腔。 Schulze等（ 1994）指出，高精氨酸法必須使經(jīng)胍基化的高精氨酸在待測飼料蛋白質(zhì)中均勻分布，才能有代表性，否則影響測定結(jié)果。如果飼料蛋白質(zhì)中的賴氨酸側(cè)鏈被封閉，特別是經(jīng)邁拉德反應(yīng)后封閉時，賴氨酸側(cè)鏈就不能與甲基異脲反應(yīng)而轉(zhuǎn)化成高精氨酸。這樣受熱損害的飼料蛋白質(zhì)經(jīng)胍基化后的代表性差，從而導(dǎo)致對內(nèi)源性氮的估測誤差。 瘤胃降解蛋白和瘤胃未降解蛋白 ? 反芻動物的日糧蛋白（氮）可以根據(jù)其在瘤胃的可降解性分為快速可降解部分、可降解部分和不可降解部分。 瘤胃降解和小腸消化的日糧氮組分 組分 主要化合物 瘤胃降解 /(%/h) 腸道消化率 /% A 氨、硝酸鹽、氨基酸、肽 持續(xù)不斷 不會到達腸道 B1 球蛋白、某些清蛋白 200～ 300 100 B2 大多數(shù)清蛋白、面筋蛋白 5～ 15 100 B3 細胞壁蛋白、變性蛋白、醇溶谷蛋白 ～ C 邁拉德反應(yīng)產(chǎn)物、與木質(zhì)素連接的氮、單寧結(jié)合蛋白 0 0 降解率的體內(nèi)測定 ? 體內(nèi)測定降解率需測定日糧攝入氮（ FIN）、內(nèi)源氮（ EN），通過十二指腸中來源于日糧的非氨態(tài)氮（ NAN），和微生物氮（ MIN）。這樣日糧氮的降解率（ Dy）可以用下面的公式表示： ? Dy=1[NAN（ MIN+EN） ]/FIN ? 這一方法需準(zhǔn)確測定十二指腸的食糜流量、微生物氮和內(nèi)源氮含量，這些參數(shù)的測定需使用雙指示劑和同位素標(biāo)記技術(shù)，會使測定結(jié)果有較大誤差。內(nèi)源氮含量隨動物種類和飼養(yǎng)水平不同有一定差異，約占 ％～ ％，常用 ％作為估計值。盡管這一方法不十分準(zhǔn)確，但是它是目前測定氮降解率絕對值的唯一可用方法，且用作檢驗其他測定方法準(zhǔn)確性的標(biāo)準(zhǔn)。 瘤胃尼龍袋法測定氮降解率 ? 將飼料裝入一個人造纖維袋，然后將袋懸于瘤胃內(nèi)。經(jīng)過一定時間后，比較放入瘤胃前后的氮含量變化。 ? 降解率（ %） =（放入瘤胃前氮含量－從瘤胃取出后氮含量） /放入瘤胃前氮含量 ? 由于纖維袋中的蛋白質(zhì)消失率與時間相關(guān)，并隨時間的延長而增加，但隨著時間的延長，增加的幅度變小。該測定方法也有許多導(dǎo)致分析誤差的因素，如樣品大小、纖維袋大小、纖維材料的多孔性、袋從瘤胃取出以后的處理等。 ? ARC（ 1992）提出了該測定方法的技術(shù)規(guī)程。這一方法假設(shè)纖維袋中的氮消失率能夠反映飼料氮在瘤胃液中的溶解性，即降解率。但事實上，有時飼料蛋白溶解后并沒有降解就離開了瘤胃，而且最近發(fā)現(xiàn)不可降解的飼料酸性洗滌不溶性氮（ ADIN），可以在瘤胃孵育過程中消失，另外瘤胃細菌進入纖維袋中，從而增加未降解氮的含量。