【正文】 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的功能 ? 利用腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖的特性 ? 利用細(xì)胞融合的技術(shù)將兩種細(xì)胞融合獲得具有淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞特性的雜交瘤細(xì)胞 ? 利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞 二、雜交瘤技術(shù)的基本原理 單克隆抗體制備過程 注射抗原 B淋巴細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞 細(xì)胞融合、篩選 雜交瘤細(xì)胞 細(xì)胞培養(yǎng) 篩選，繼續(xù)培養(yǎng) 足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細(xì)胞群 體外培養(yǎng) 注射到小鼠腹腔 單克隆抗體 三、雜交瘤細(xì)胞的制備 （一）骨髓瘤細(xì)胞選擇及選擇性培養(yǎng)基 ?骨髓瘤細(xì)胞本身不能分泌抗體 ?選擇次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（ HGPRT） ?胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（ TK） HAT培養(yǎng)基 次黃嘌呤（ hypoxanthine， H） 氨基喋呤（ aminopterin， A） 胸腺嘧啶脫氧核苷（ thymidine， T） 次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（ HGPRT） 胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（ TK） HAT培養(yǎng)基通過抑制瘤細(xì)胞的核苷酸合成，達(dá)到去除未融合瘤細(xì)胞的目的。細(xì)胞有兩條基本途徑合成嘌呤核苷酸，一條是從磷酸核糖、氨基酸、CO2和 NH3等化合物開始，葉酸是重要的輔酶，而 氨甲蝶呤 是葉酸的拮抗劑，可阻斷瘤細(xì)胞通過這一途徑合成核苷酸。另一條途徑是利用已存在的堿基，經(jīng)特異的磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶催化合成核苷酸，如 次黃嘌呤經(jīng)過次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（ HGPRT） 轉(zhuǎn)變?yōu)猷堰屎塑账帷Ｈ诤纤玫牧黾?xì)胞是選擇出來(lái)的HGPRT缺陷細(xì)胞株，因此不能在 HAT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而且不合成或不分泌免疫球蛋白。只有融合細(xì)胞具有親代雙方的遺傳性能，可在 HAT培養(yǎng)基中長(zhǎng)期存活與繁殖并分泌抗體。 （二）免疫小鼠 免疫程序是取 6— 8周齡 Balb／ C雌鼠，基礎(chǔ)免疫 2周，靜脈再加強(qiáng)免疫一次， 3— 5天后用于融合。免疫時(shí)是否采用佐劑和事先處理抗原，要依抗原性的強(qiáng)弱而定。一般來(lái)講可溶性抗原用完全佐劑效果較好?？乖客瑯优c抗原強(qiáng)弱有關(guān)，以 IgG為例，第一次為 loo?g， 第二次為50?g，免疫途徑第一次可經(jīng)腹腔注射。對(duì)于細(xì)胞性抗原不用佐劑，每次腹腔注射 1 l06一 1 107。 （三）脾細(xì)胞的制備 (1)引頸處死小鼠，用酒精消毒體表； (2)無(wú)菌條件下取出脾臟，剃除結(jié)締組織和脂肪，用 5ml無(wú)血清培養(yǎng)液沖洗一次； (3)把脾臟置于已消毒的 90一 100目不銹鋼網(wǎng)或尼龍紗網(wǎng)中； (4)在脾中部切開一小口，用注射器芯從一端輕輕壓擠，再用無(wú)血清培養(yǎng)液沖洗， 令細(xì)胞通過紗網(wǎng)，收集入平皿中，或用注射器向脾臟內(nèi)注入 3ml無(wú)血清培養(yǎng) 液，反復(fù)抽吸數(shù)次方法獲取細(xì)胞，再制成細(xì)胞懸液亦可； (5)把細(xì)胞懸液注入 50ml離心管中，加 l0一 20ml培養(yǎng)液：輕輕吹打數(shù)次，室溫中 置 5分鐘； (6)離心 (800一 1000轉(zhuǎn)／分 )計(jì)數(shù)、備用。 （四）細(xì)胞準(zhǔn)備 （ 1）收集骨髓瘤細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗 3次 (37℃) ，計(jì)數(shù)活力細(xì)胞 (不少于 90％ )； （ 2）收集小鼠脾細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗 3次 (37℃) ，并計(jì)細(xì)胞數(shù)和測(cè)定活力細(xì)胞； （ 3）按 1： 5或 1： 10混合脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞后，離心棄去上清，并以消毒濾 紙吸 凈多余上清。 （五）細(xì)胞融合 (1)將 1ml 40％的 PEG液一滴滴加入列細(xì)胞團(tuán)中，在 60秒內(nèi)加完，同時(shí)并不斷輕微 轉(zhuǎn)動(dòng)離心管或用手指輕彈離心管； (2)在不斷轉(zhuǎn)動(dòng)離心管中加 1ml無(wú)血清培養(yǎng)液， 60秒鐘內(nèi)加完； (3)于 5分鐘內(nèi)慢慢加完 20ml無(wú)血清培養(yǎng)液；此時(shí)細(xì)胞對(duì)機(jī)械損傷非常敏感， (4)離心 (800轉(zhuǎn)／分， 8分鐘 )，去上清，用完全培養(yǎng)液 10ml懸浮，輕輕混勻； (5)取 96孔板，每孔加 50?l； (6)取等體積細(xì)胞懸液，向另一 96孔板中加 50P1； (7)送入 5％ CO2，溫箱中 37℃ 培養(yǎng)， 24小時(shí)后更換成 HAT選擇性培養(yǎng)掖。 （六）融合后細(xì)胞培養(yǎng) (1)融合后 7— 10天用 HAT培養(yǎng)液半量換液 (留一半舊的加一半新的 ) 后每隔 2— 3天 半量換液一次； (2)兩周后可改用 HA培養(yǎng)液半量換液，或仍用 HAT培養(yǎng)液； (3)2— 3周后出現(xiàn)雜交細(xì)胞集落，細(xì)胞個(gè)大、圓且透明； (4)待集落增殖生長(zhǎng)至 1／ 3孔時(shí)，應(yīng)進(jìn)行抗體檢測(cè)。 思考： 本過程利用了哪些原理？ 免疫原理，細(xì)胞融合原理和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)原理 為什么選用小鼠骨髓瘤細(xì)胞與 B細(xì)胞融合？ 這樣融合成的雜交瘤細(xì)胞，繼承了雙親細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，不僅具有 B細(xì)胞分泌抗體的能力，而且還有無(wú)限增殖的本領(lǐng)，因而可以獲得大量單克隆抗體 單克隆抗體的應(yīng)用 與常規(guī)抗體相比，單克隆抗體產(chǎn)量高，特異性強(qiáng)，靈敏度高，優(yōu)越性十分明顯 。 應(yīng)用主要有： 臨床診斷 作為載體，運(yùn)載抗癌藥物，形成“生物導(dǎo)彈”治療腫瘤 資料 ： 目前世界各國(guó)已經(jīng)研制出數(shù)以百計(jì)的單克隆抗體。許多缺乏良好診斷手段的傳染病、免疫性疾病、血液病、內(nèi)分泌疾病和遺傳病，用單克隆抗體作為診斷手段，是一個(gè)必然趨勢(shì)。另外，用單克隆抗體做體內(nèi)診斷，借以鑒別和定位體內(nèi)“病灶”也引起人們的注意，目前，主要用于腫瘤追蹤及心肌梗塞的診斷。 植物體細(xì)胞雜交和動(dòng)物細(xì)胞融合的比較 比較項(xiàng)目 植物體細(xì)胞雜交 動(dòng)物細(xì)胞融合 細(xì)胞融合原理 細(xì)胞膜的流動(dòng)性 細(xì)胞膜的流動(dòng)性 細(xì)胞融合的方法 去除細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合 使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合 誘導(dǎo)方法 物理（離心、振蕩、電刺激） 化學(xué)（聚乙二醇） 物理、化學(xué)方法（同左） 滅活的病毒 用途 獲得雜種植株 制備單克隆抗體 4） 細(xì)胞核移植技術(shù) ? 277 次乳腺細(xì)胞核移植實(shí)驗(yàn)； ? 獲得 29個(gè)發(fā)育為8細(xì)胞的 “ 胚 ” ； ? 13頭代孕母親； ? 1996年 7月 5日 ，羊羔 6LL3， 被命名為 “ 多莉 ” 。 預(yù)想的克隆人技術(shù)路線 動(dòng)物的胚胎移植 解決某些妊娠時(shí)間長(zhǎng)、每胎產(chǎn)子數(shù)量少的優(yōu)良種畜的繁殖速度問題。 胚胎移植技術(shù) 試管動(dòng)物（嬰兒）培養(yǎng)過程 卵細(xì)胞 精子 體外受精 受精卵 胚胎 新個(gè)體 母體子宮內(nèi) 孕育、產(chǎn)出 一、動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動(dòng)物 動(dòng)物細(xì)胞全能性的表現(xiàn)程度不同 受精卵 胚胎干細(xì)胞 多能干細(xì)胞 單能干細(xì)胞 體細(xì)胞 核移植 胚胎細(xì)胞核移植 體細(xì)胞核移植（難度高） 動(dòng)物體細(xì)胞核移植 是將動(dòng)物的一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核 ,移如入一個(gè)已經(jīng)去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中 .使其重組并發(fā)育成一個(gè)新的胚胎 ,這個(gè)新的胚胎最終發(fā)育為動(dòng)物個(gè)體。 去核卵細(xì)胞 體細(xì)胞核 細(xì)胞核移植 重組細(xì)胞 電脈沖刺激 早期胚胎 (或重組胚胎） 胚胎移植 母體子宮 妊娠、出生 個(gè)體 原理 動(dòng)物體細(xì)胞核具有全能性 卵細(xì)胞 Ａ母綿羊 Ｂ母綿羊 乳腺細(xì)胞 細(xì)胞質(zhì) 細(xì)胞核 細(xì)胞核移植 早期胚胎 卵裂 C母綿羊子宮 胚胎移植 多莉羊 分娩 妊娠 多莉羊的培育過程 融合后的卵細(xì)胞 克隆羊的成功證明了什么？ 動(dòng)物體細(xì)胞核具有全能性； 細(xì)胞質(zhì)具有調(diào)控細(xì)胞核發(fā)育的作用。 動(dòng)物體細(xì)胞核移植是一種無(wú)性繁殖技術(shù)，用核移植的方法得到的動(dòng)物稱為克隆動(dòng)物。 動(dòng)物細(xì)胞特點(diǎn)？ ?分化潛能變窄 ：隨著細(xì)胞分化程度的提高而逐漸受到限制，分化潛能變窄，這是指整體細(xì)胞而言。 ?細(xì)胞核仍具有全能性 ： 細(xì)胞核，它含有保持物種遺傳性所需的全套基因，而且并沒有因細(xì)胞分化而丟失基因，因此高度分化細(xì)胞的 細(xì)胞核 仍具有全能性 根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞核仍具有全能性的特點(diǎn) ,怎樣將動(dòng)物細(xì)胞的全能性表達(dá) ? 利用動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù) 克隆動(dòng)物的研究意義 ，生產(chǎn)醫(yī)用蛋白 ，作為供體 體細(xì)胞核移植技術(shù)存在的問題 ，如體型過大，異常肥胖，發(fā)育困難，免疫失調(diào)等。 。 小結(jié) 兩個(gè)過程 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程 單克隆抗體制備過程 三個(gè)“一” 一個(gè)誘導(dǎo)細(xì)胞融合的新方法 －－滅活病毒 一個(gè)新細(xì)胞－－雜交瘤細(xì)胞 一個(gè)優(yōu)勢(shì)－－單克隆抗體特異性 強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)勢(shì) 5）染色體工程技術(shù) 染色體工程是按人們的需要來(lái)添加、削減或替換生物的染色體的一種技術(shù)。主要分為動(dòng)物染色體工程玫植物染色體工程 5）胚胎工程技術(shù) 六、細(xì)胞工程技術(shù)的應(yīng)用 ?優(yōu)質(zhì)植物快速培育與繁殖 ?動(dòng)物胚胎工程快速繁殖優(yōu)良、瀕危品種 ?利用動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)活性產(chǎn)物、藥品。 ?新型動(dòng)植物品種的培育。 ?在醫(yī)學(xué)器官修復(fù)或移植中的應(yīng)用。 ?制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物的生物反應(yīng)器。 ?珍稀動(dòng)植物資源的保存與保護(hù)。 ?在遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等領(lǐng)域的理論研究。 ?在能源、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域的應(yīng)用