【正文】 的體細(xì)胞融合在一起，遇到的第一個(gè)障礙是什么？ （ 2）有沒有一種溫和的去細(xì)胞壁的方法？ （ 3）為什么兩個(gè)原生質(zhì)體能發(fā)生融合，這與細(xì)胞膜的什么特性有關(guān)？ （ 4）如果兩個(gè)來源不同的原生質(zhì)體發(fā)生融合形成了雜種細(xì)胞，下一步該對此細(xì)胞做何種處理？ （ 5）如何將雜種細(xì)胞培育成雜種植株？ 植物體細(xì)胞雜交過程 植物細(xì)胞 A 植物細(xì)胞 B 去掉細(xì)胞壁 去掉細(xì)胞壁 原生質(zhì)體 A 原生質(zhì)體 B 原生質(zhì)體融合 雜合的原生質(zhì)體 再生出細(xì)胞壁 雜種細(xì)胞 細(xì)胞分裂 分化發(fā)育 愈傷組織 雜種植株 植物體細(xì)胞雜交過程 原生質(zhì)體制備（酶解法去細(xì)胞壁） 原生質(zhì)體融合（人工誘導(dǎo)） 雜種細(xì)胞的篩選和培養(yǎng)（形成愈傷組織） 雜種植株的再生與鑒定 物理法： 離心、振動(dòng)、電刺激等 化學(xué)法： 聚乙二醇等試劑 纖維素酶、果膠酶等 問題 ? 為什么“番茄 — 馬鈴薯”超級雜種植株沒有如科學(xué)家所想像的那樣，地上長番茄、地下結(jié)馬鈴薯？ ? 主要原因是：生物基因的表達(dá)不是孤立的，它們之間是相互調(diào)控、相互影響的，所以馬鈴薯 — 番茄雜交植株的細(xì)胞中雖然具備兩個(gè)物種的遺傳物質(zhì)，但這些遺傳物質(zhì)的表達(dá)受到相互干擾，不能再像馬鈴薯或番茄植株中的遺傳物質(zhì)一樣有序表達(dá)，雜交植株不能地上長番茄、地下結(jié)馬鈴薯就是很自然的了。 碳源和能源 維生素 植物細(xì)胞的生長都需要硫胺素 。 復(fù)合物質(zhì) 在植物細(xì)胞的培養(yǎng)過程中 ， 酶母抽提液 、 麥芽抽提液 、 椰子汁和水果汁等復(fù)合物質(zhì)通?？梢宰鳛榧?xì)胞的生長劑 。 1907年，美國生物學(xué)家哈里森 (Harrison)從蝌蚪的脊索中分離出神經(jīng)組織，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培養(yǎng)。 細(xì)胞系： 細(xì)胞株傳代至 50代后又出現(xiàn)細(xì)胞生長停滯狀態(tài)，只有部分細(xì)胞由于遺傳物質(zhì)的改變，使其在培養(yǎng)條件下可以無限制傳代，這種傳代細(xì)胞為細(xì)胞系。 ? ? 三 、 培養(yǎng)條件 細(xì)胞在體外培養(yǎng)中所需的條件 與體內(nèi)細(xì)胞基本相同。 用來檢測 PH的變化：紅色 ， ?橙色 ，黃色 ，藍(lán)紅色 ，紫色 。 合成 培養(yǎng)基 ? 1951年厄爾開發(fā)了供動(dòng)物細(xì)胞體外生長的人工合成培養(yǎng)基 (MEM)。它含有許多維持細(xì)胞生長繁殖和保持細(xì)胞生物學(xué)性狀不可缺少的未知成分。 ?氨基酸是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的基本成分，氨基酸中有 12種是細(xì)胞本身不合成的，必須由培養(yǎng)液提供。另外高質(zhì)量的動(dòng)物血清來源有限，成本高，限制了它的大量使用。 四 細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)施 實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì) 細(xì)胞培養(yǎng)是一種無菌操作技術(shù)，要求工作環(huán)境和條件必須 保證無微生物污染 和不受其它有害因素的影響。風(fēng)淋室可以配合加熱器，冬天可以加熱，溫度可調(diào)，一般控制溫度在 3035℃ 較為適宜。微化濾膜濾器是目前應(yīng)用最廣泛的過濾裝置。 火焰消毒 ? 所使用物品均應(yīng)經(jīng)過燒灼，所用瓶口等開啟或封蓋時(shí)均需迅速旋轉(zhuǎn)過火焰進(jìn)行消毒。獨(dú)特之處有： 液體培養(yǎng)基 成分中有動(dòng)物血清等 因?yàn)檫@些組織或器官上的細(xì)胞生命力旺盛，分裂能力強(qiáng) 成塊組織不利培養(yǎng)，分散了做成細(xì)胞懸浮液利于培養(yǎng) 不能，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)只能使細(xì)胞數(shù)目增多，不能發(fā)育成新的動(dòng)物個(gè)體 3）細(xì)胞融合技術(shù)（體細(xì)胞雜交技術(shù)） 細(xì)胞融合是正常的生命活動(dòng) 兩個(gè)細(xì)胞正在融合 受精作用 動(dòng)物細(xì)胞融合 細(xì)胞 A 細(xì)胞 B 雜種細(xì)胞 滅活的病毒 物理法 化學(xué)法 仙臺病毒 皰疹病毒 新城雞瘟病毒 用滅活的病毒誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合過程 細(xì)胞核 病毒顆粒 細(xì)胞核 細(xì)胞融合與融合誘導(dǎo)細(xì)胞融合物質(zhì) 誘導(dǎo)劑： 仙臺病毒 聚乙二醇 電融合 誘導(dǎo)細(xì)胞融合的仙臺病毒必須滅活。這 對于種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠(yuǎn)的意義。 ?聚乙二醇 (PEG)結(jié)構(gòu)為： HOH2C（ CH20CH2） nCH2OH，分子量大于 200小于 6000者均可用作細(xì)胞融合劑。 聚乙二醇（ PEG）法 細(xì)胞融合步驟 （ 1）將兩種不同親本細(xì)胞各 5 l06混勻； （ 2）離心沉淀，吸去上清液； （ 3）加 1ml 50％ PEG溶液，用吸管吹打，使之與細(xì)胞接觸 1分鐘； （ 4）加 9ml 培養(yǎng)液，離心沉淀，吸去上清液； （ 5）加 5ml 培養(yǎng)液，分別接種 5個(gè)直徑 60mm平皿，每個(gè)平皿加培養(yǎng) 液至 5ml， 37℃ 的 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 ? 如親本 1：葉綠體缺陷型 親本 2：光致死型 兩親本在光照下一種死亡，另一種呈白 色，融合細(xì)胞長成植株呈綠色，并能成長 ?2） 抗性互補(bǔ)篩選法： 利用親本細(xì)胞原生質(zhì)體對抗生素、除草劑及其它有毒物質(zhì)抗性差異選擇雜種細(xì)胞。 ?3） 溫度敏感突變型 雜種細(xì)胞的篩選：一般的培養(yǎng)細(xì)胞能在 32度到 40度的范圍內(nèi)生長，但溫度敏感突變型的細(xì)胞能在高溫或低溫下生長。 ? 目標(biāo)：地上和地下部兼用種、固氮禾等 具有兩種不同優(yōu)勢性狀的新品種 。因此，單克隆抗體技術(shù)又稱為雜交瘤技術(shù) (hybridoma technology ）。一般來講可溶性抗原用完全佐劑效果較好。 應(yīng)用主要有： 臨床診斷 作為載體，運(yùn)載抗癌藥物，形成“生物導(dǎo)彈”治療腫瘤 資料 ： 目前世界各國已經(jīng)研制出數(shù)以百計(jì)的單克隆抗體。 動(dòng)物細(xì)胞特點(diǎn)？ ?分化潛能變窄 ：隨著細(xì)胞分化程度的提高而逐漸受到限制，分化潛能變窄，這是指整體細(xì)胞而言。 ?珍稀動(dòng)植物資源的保存與保護(hù)。主要分為動(dòng)物染色體工程玫植物染色體工程 5）胚胎工程技術(shù) 六、細(xì)胞工程技術(shù)的應(yīng)用 ?優(yōu)質(zhì)植物快速培育與繁殖 ?動(dòng)物胚胎工程快速繁殖優(yōu)良、瀕危品種 ?利用動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)活性產(chǎn)物、藥品。 預(yù)想的克隆人技術(shù)路線 動(dòng)物的胚胎移植 解決某些妊娠時(shí)間長、每胎產(chǎn)子數(shù)量少的優(yōu)良種畜的繁殖速度問題。 （四）細(xì)胞準(zhǔn)備 （ 1）收集骨髓瘤細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液洗 3次 (37℃) ，計(jì)數(shù)活力細(xì)胞 (不少于 90％ )； （ 2）收集小鼠脾細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液洗 3次 (37℃) ，并計(jì)細(xì)胞數(shù)和測定活力細(xì)胞； （ 3）按 1： 5或 1： 10混合脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞后，離心棄去上清，并以消毒濾 紙吸 凈多余上清。融合所用的瘤細(xì)胞是選擇出來的HGPRT缺陷細(xì)胞株，因此不能在 HAT培養(yǎng)基中生長，而且不合成或不分泌免疫球蛋白。 ２．動(dòng)物體內(nèi)的 B淋巴細(xì)胞可以產(chǎn)生百萬種以上的抗體，每種抗體對特定的抗原具有特異性免疫作用。 ?雜種細(xì)胞能在高溫和含卡娜霉素的培養(yǎng)基上生長。 動(dòng)物細(xì)胞的篩選方式： ?1） 利用抗藥性篩選系統(tǒng) ：利用生物細(xì)胞對藥物敏感性差異篩選雜種細(xì)胞。 電融合的基本過程： 細(xì)胞膜的接觸： 當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時(shí)，電場通電后，電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電場作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串； 膜的擊穿： 原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個(gè)緊密接觸的細(xì)胞融合在一起。 ?PEG溶液在 。 細(xì)胞融合的基本原理 顯微鏡下細(xì)胞融合過程 融合過程中兩個(gè)細(xì)胞膜從彼此接觸到破裂形成細(xì)胞橋的變化過程圖解 用滅活的病毒誘導(dǎo)的動(dòng)物細(xì)胞融合過程示意圖 細(xì)胞融合的常用方法 一、仙臺病毒法 仙臺病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合經(jīng)四個(gè)階段： ①兩種細(xì)胞在一起培養(yǎng)，加入病毒，在 4℃ 條件下病毒附著在細(xì)胞 膜上。 ?1974年華裔加拿大學(xué)者高國楠?jiǎng)?chuàng)立了聚乙二醇（ PEG）化學(xué)融合法。 ?合理布局 右手使用方便的用品放右側(cè)，左手使用方便的用品放左側(cè)。 ?分析間： 顯微鏡、計(jì)算機(jī)及打印機(jī)等。 冰箱 ?細(xì)胞培養(yǎng)的冰箱應(yīng)特別注意清潔， 防止污染。 ?內(nèi)設(shè)超凈工作臺、培養(yǎng)箱等細(xì)胞培養(yǎng)的必要設(shè)備，應(yīng)具備紫外消毒、通風(fēng)及溫控設(shè)施。 3） 制霉菌素：濃度 25U/ml，小瓶分裝，每瓶一次用完。一般配制成 0． 5％溶液，微酸性。 ?常用的動(dòng)物血清主要有牛血清和馬血清。最普遍的作法是加入小牛血清。 開放培養(yǎng)時(shí)一般把細(xì)胞置于 95%空氣加 5%二氧化碳混合氣體環(huán)境中 。人體細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)溫度為 ℃ 177。 二 培養(yǎng)工具 : ?培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)管、 多孔培養(yǎng)板 等。 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用和概念： 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)就是從動(dòng)物有機(jī)體中取出相關(guān)的組織 ,將它分散成單個(gè)細(xì)胞 ,然后 ,放在適宜的培養(yǎng)基中 ,讓這些細(xì)胞生長和增殖 . 動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)過程 幼齡動(dòng)物 取動(dòng)物器官 和組織 剪碎組織 胰蛋白酶處理 細(xì)胞培 養(yǎng) 單個(gè)細(xì)胞 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 是其他動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ) 剪碎組織的目的？ 胰蛋白酶處理