【正文】 ?在遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等領(lǐng)域的理論研究。 ?制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物的生物反應(yīng)器。 ?新型動(dòng)植物品種的培育。 小結(jié) 兩個(gè)過程 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程 單克隆抗體制備過程 三個(gè)“一” 一個(gè)誘導(dǎo)細(xì)胞融合的新方法 －－滅活病毒 一個(gè)新細(xì)胞－－雜交瘤細(xì)胞 一個(gè)優(yōu)勢－－單克隆抗體特異性 強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)勢 5）染色體工程技術(shù) 染色體工程是按人們的需要來添加、削減或替換生物的染色體的一種技術(shù)。 ?細(xì)胞核仍具有全能性 ： 細(xì)胞核，它含有保持物種遺傳性所需的全套基因，而且并沒有因細(xì)胞分化而丟失基因，因此高度分化細(xì)胞的 細(xì)胞核 仍具有全能性 根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞核仍具有全能性的特點(diǎn) ,怎樣將動(dòng)物細(xì)胞的全能性表達(dá) ? 利用動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù) 克隆動(dòng)物的研究意義 ，生產(chǎn)醫(yī)用蛋白 ，作為供體 體細(xì)胞核移植技術(shù)存在的問題 ，如體型過大，異常肥胖，發(fā)育困難，免疫失調(diào)等。 動(dòng)物體細(xì)胞核移植是一種無性繁殖技術(shù)，用核移植的方法得到的動(dòng)物稱為克隆動(dòng)物。 胚胎移植技術(shù) 試管動(dòng)物（嬰兒）培養(yǎng)過程 卵細(xì)胞 精子 體外受精 受精卵 胚胎 新個(gè)體 母體子宮內(nèi) 孕育、產(chǎn)出 一、動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動(dòng)物 動(dòng)物細(xì)胞全能性的表現(xiàn)程度不同 受精卵 胚胎干細(xì)胞 多能干細(xì)胞 單能干細(xì)胞 體細(xì)胞 核移植 胚胎細(xì)胞核移植 體細(xì)胞核移植（難度高） 動(dòng)物體細(xì)胞核移植 是將動(dòng)物的一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核 ,移如入一個(gè)已經(jīng)去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中 .使其重組并發(fā)育成一個(gè)新的胚胎 ,這個(gè)新的胚胎最終發(fā)育為動(dòng)物個(gè)體。 植物體細(xì)胞雜交和動(dòng)物細(xì)胞融合的比較 比較項(xiàng)目 植物體細(xì)胞雜交 動(dòng)物細(xì)胞融合 細(xì)胞融合原理 細(xì)胞膜的流動(dòng)性 細(xì)胞膜的流動(dòng)性 細(xì)胞融合的方法 去除細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合 使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合 誘導(dǎo)方法 物理（離心、振蕩、電刺激） 化學(xué)（聚乙二醇） 物理、化學(xué)方法（同左） 滅活的病毒 用途 獲得雜種植株 制備單克隆抗體 4） 細(xì)胞核移植技術(shù) ? 277 次乳腺細(xì)胞核移植實(shí)驗(yàn)； ? 獲得 29個(gè)發(fā)育為8細(xì)胞的 “ 胚 ” ； ? 13頭代孕母親； ? 1996年 7月 5日 ，羊羔 6LL3， 被命名為 “ 多莉 ” 。許多缺乏良好診斷手段的傳染病、免疫性疾病、血液病、內(nèi)分泌疾病和遺傳病，用單克隆抗體作為診斷手段，是一個(gè)必然趨勢。 思考： 本過程利用了哪些原理？ 免疫原理，細(xì)胞融合原理和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)原理 為什么選用小鼠骨髓瘤細(xì)胞與 B細(xì)胞融合？ 這樣融合成的雜交瘤細(xì)胞，繼承了雙親細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，不僅具有 B細(xì)胞分泌抗體的能力，而且還有無限增殖的本領(lǐng)，因而可以獲得大量單克隆抗體 單克隆抗體的應(yīng)用 與常規(guī)抗體相比，單克隆抗體產(chǎn)量高，特異性強(qiáng)，靈敏度高，優(yōu)越性十分明顯 。 （五）細(xì)胞融合 (1)將 1ml 40％的 PEG液一滴滴加入列細(xì)胞團(tuán)中，在 60秒內(nèi)加完，同時(shí)并不斷輕微 轉(zhuǎn)動(dòng)離心管或用手指輕彈離心管； (2)在不斷轉(zhuǎn)動(dòng)離心管中加 1ml無血清培養(yǎng)液， 60秒鐘內(nèi)加完； (3)于 5分鐘內(nèi)慢慢加完 20ml無血清培養(yǎng)液；此時(shí)細(xì)胞對(duì)機(jī)械損傷非常敏感， (4)離心 (800轉(zhuǎn)／分， 8分鐘 )，去上清，用完全培養(yǎng)液 10ml懸浮，輕輕混勻； (5)取 96孔板，每孔加 50?l； (6)取等體積細(xì)胞懸液，向另一 96孔板中加 50P1； (7)送入 5％ CO2，溫箱中 37℃ 培養(yǎng)， 24小時(shí)后更換成 HAT選擇性培養(yǎng)掖。 （三）脾細(xì)胞的制備 (1)引頸處死小鼠，用酒精消毒體表； (2)無菌條件下取出脾臟，剃除結(jié)締組織和脂肪，用 5ml無血清培養(yǎng)液沖洗一次； (3)把脾臟置于已消毒的 90一 100目不銹鋼網(wǎng)或尼龍紗網(wǎng)中； (4)在脾中部切開一小口，用注射器芯從一端輕輕壓擠，再用無血清培養(yǎng)液沖洗， 令細(xì)胞通過紗網(wǎng)，收集入平皿中，或用注射器向脾臟內(nèi)注入 3ml無血清培養(yǎng) 液，反復(fù)抽吸數(shù)次方法獲取細(xì)胞，再制成細(xì)胞懸液亦可； (5)把細(xì)胞懸液注入 50ml離心管中，加 l0一 20ml培養(yǎng)液：輕輕吹打數(shù)次，室溫中 置 5分鐘； (6)離心 (800一 1000轉(zhuǎn)／分 )計(jì)數(shù)、備用?？乖客瑯优c抗原強(qiáng)弱有關(guān)，以 IgG為例，第一次為 loo?g， 第二次為50?g，免疫途徑第一次可經(jīng)腹腔注射。免疫時(shí)是否采用佐劑和事先處理抗原，要依抗原性的強(qiáng)弱而定。只有融合細(xì)胞具有親代雙方的遺傳性能，可在 HAT培養(yǎng)基中長期存活與繁殖并分泌抗體。另一條途徑是利用已存在的堿基，經(jīng)特異的磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶催化合成核苷酸，如 次黃嘌呤經(jīng)過次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（ HGPRT） 轉(zhuǎn)變?yōu)猷堰屎塑账帷? Niels K. Jerne G. Kohler C. Milstein 如何大量生產(chǎn)單克隆抗體？ ? 利用淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的功能 ? 利用腫瘤細(xì)胞無限增殖的特性 ? 利用細(xì)胞融合的技術(shù)將兩種細(xì)胞融合獲得具有淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞特性的雜交瘤細(xì)胞 ? 利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞 二、雜交瘤技術(shù)的基本原理 單克隆抗體制備過程 注射抗原 B淋巴細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞 細(xì)胞融合、篩選 雜交瘤細(xì)胞 細(xì)胞培養(yǎng) 篩選，繼續(xù)培養(yǎng) 足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細(xì)胞群 體外培養(yǎng) 注射到小鼠腹腔 單克隆抗體 三、雜交瘤細(xì)胞的制備 （一）骨髓瘤細(xì)胞選擇及選擇性培養(yǎng)基 ?骨髓瘤細(xì)胞本身不能分泌抗體 ?選擇次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（ HGPRT） ?胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（ TK） HAT培養(yǎng)基 次黃嘌呤（ hypoxanthine， H） 氨基喋呤（ aminopterin， A） 胸腺嘧啶脫氧核苷（ thymidine， T） 次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（ HGPRT） 胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（ TK） HAT培養(yǎng)基通過抑制瘤細(xì)胞的核苷酸合成，達(dá)到去除未融合瘤細(xì)胞的目的。 特點(diǎn)： 特異性強(qiáng)、靈敏度高 只針對(duì)某一抗原決定簇 單克隆抗體技術(shù)的核心是用 骨髓瘤細(xì)胞 (myeloma cell)與經(jīng)特定抗源免疫刺激的 B淋巴細(xì)胞 (antigen stimulated B lymphoblast)融合得到 雜交瘤細(xì)胞 (hybridoma cell)，雜交瘤細(xì)胞既能象骨髓瘤細(xì)胞那樣在體外無限增殖，又具有 B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。 ３．每一個(gè)淋巴細(xì)胞只能產(chǎn)生一種抗體。 B淋巴細(xì)胞與抗體 １． B淋巴細(xì)胞受抗原刺激后，可以產(chǎn)生抗體。 細(xì)胞融合技術(shù) 在食品工業(yè)中的應(yīng)用 ?（ 1）酵母菌的育種 ?（ 2）氨基酸生產(chǎn)菌的育種 ?（ 3）酶制劑生產(chǎn)菌株的育種 細(xì)胞雜交瘤技術(shù) 與單克隆抗體 一、何謂單克隆抗體？ 什么是抗體？ 抗體是機(jī)體受抗原刺激后產(chǎn)生的、并能與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。 ? 一些近親植物、有性不親和的組合，如馬鈴薯 番茄等都得到了再生植株。 雜種細(xì)胞在植物育種中的應(yīng)用 ? 雜種細(xì)胞 是一條 新的育種途徑 ，可以產(chǎn)生新經(jīng)濟(jì)性狀的良種。 ?親本二：高溫敏感突變型，但不能抗卡娜霉素。由此篩選雜種細(xì)胞。 ?親本 A：色氨酸缺陷型 ?親本 B：蘇氨酸缺陷型 ?雜種細(xì)胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，而親本細(xì)胞均會(huì)死亡。 ?親本 A：對(duì)氨芐青霉素敏感，對(duì)卡娜霉素不敏感 ?親本 B：對(duì)卡娜霉素敏感，對(duì)氨芐青霉素不敏感 ?雜種細(xì)胞可以在含有兩種抗生素的培養(yǎng)基上生長 ?2） 營養(yǎng)互補(bǔ)篩選系統(tǒng)： 細(xì)胞在缺乏一種或幾種營養(yǎng)成分時(shí)，不能生長繁殖，即營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞。 ?例如粉蘭煙草與朗氏煙草細(xì)胞原生質(zhì)體均需外源激素才能生長，但其融合細(xì)胞可以產(chǎn)生內(nèi)源激素，在培養(yǎng)基上不需加激素。 ?如： ?親本 1：對(duì)放線菌素 D抗性，但在 MS培養(yǎng)基上不能超過 50個(gè)世代 ?親本 2：對(duì)放線菌素 D很敏感，但能在MS上生長 ?雜種細(xì)胞能在含有放線菌素的 MS培養(yǎng)基上生長，而親本和其它細(xì)胞死亡 3） 利用物理特性篩選法： 根據(jù)親本的原生質(zhì)體大小、顏色、漂浮密度及電泳遷移率、形成的愈傷組織的差異篩選雜種細(xì)胞。 ? 6） 核質(zhì)體 ：有細(xì)胞核而帶有少量細(xì)胞質(zhì)的亞原生質(zhì)體 ?基于酶缺陷型細(xì)胞和藥物抗性所建立的雜種篩選 ?基于營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞所建立的雜種篩選 ?由溫度敏感型細(xì)胞組成的雜種細(xì)胞的篩選 ?具有所需性狀雜種細(xì)胞的篩選 常用的雜種細(xì)胞篩選方法 植物細(xì)胞篩選方式 1） 遺傳互補(bǔ)篩選法： 利用每一親本貢獻(xiàn)一個(gè)功能正常等位基因，糾正另一親本的缺陷，令雜種細(xì)胞表現(xiàn)正常。 電融合誘導(dǎo)法原理示意圖 雜種細(xì)胞的篩選 雜種細(xì)胞的篩選 ? 原理： 兩種親本細(xì)胞融合的混合物中