【正文】 可能有多種類型細(xì)胞，篩選的目的是獲得優(yōu)良的雜種細(xì)胞。 電融合法的優(yōu)點(diǎn)： ?融合率高、重復(fù)性強(qiáng)、對(duì)細(xì)胞傷害??； ?裝置精巧、方法簡(jiǎn)單、可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過(guò)程； ?免去 PEG誘導(dǎo)后的洗滌過(guò)程、誘導(dǎo)過(guò)程可控性強(qiáng)。 （ 6） 6—24小時(shí)后，換成選擇培養(yǎng)液篩選雜交細(xì)胞。其缺點(diǎn)是融合過(guò)程繁瑣， PEG可能對(duì)細(xì)胞有毒害。 二、聚乙二醇（ PEG）法 聚乙二醇（ PEG）法細(xì)胞融合過(guò)程 ?PEG的作用機(jī)理 ： Kao等認(rèn)為，由于 PEG分子具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成 H鍵，從而在在質(zhì)膜之間形成分子橋，其結(jié)果是使細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生粘連進(jìn)而促使質(zhì)膜的融合；另外， PEG能增加類脂膜的流動(dòng)性，也使細(xì)胞的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。 ?通常用分子量低于 1000的 PEG作融合劑最好， 50％ PEG溶液能產(chǎn)生最多雜交細(xì)胞。 ?PEG濃度以 W/W；如將 10克 PEG與 10mlEagLe氏液混合（假定 1ml培養(yǎng)液為 1g重 )，即成 50％ PEG溶液。 用滅活的病毒誘導(dǎo)的動(dòng)物細(xì)胞融合過(guò)程示意圖 ? 優(yōu)點(diǎn)是易得，用法簡(jiǎn)單，融合效果穩(wěn)定。并使兩細(xì)胞相互凝聚； ②在 37℃ 中，病毒與細(xì)胞膜發(fā)生反應(yīng)，細(xì)胞膜受到破環(huán)，此時(shí)需 要 Ca2+和 Mg2+，最適 PH為 ； ②細(xì)胞膜連接部穿通，周邊連接部修復(fù)，此時(shí)需Ca2+和 ATP； ④融合成巨大細(xì)胞，仍需 ATP 。 ?淋巴細(xì)胞雜交瘤和單克隆抗體的制備。 ?融合過(guò)程 不存在有性雜交過(guò)程中的種性隔離機(jī)制的限制 ，為遠(yuǎn)緣物種間 的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。 細(xì)胞融合研究進(jìn)展 生物種類 細(xì)胞來(lái)源 成功年代 煙草兩個(gè)種間 苷藍(lán) —— 青菜 大豆 —— 馬唐草 矮牽牛 —— 龍面花 大麥 —— 花生 大麥 —— 大豆 小麥 —— 矮牽牛 油菜 —— 大豆 玉米 —— 大豆 大豆 —— 野豌豆 大麥 —— 蠶豆 大豆 —— 草香木犀 酵母菌 —— 雞 大豆 —— 煙草 大豆 —— 秋水仙 人 —— 胡蘿卜 番茄 —— 馬鈴薯 人 —— 小鼠 葉 —— 葉 葉 —— 根 愈傷組織 —— 葉 葉 —— 花瓣 種子 —— 種子 葉 —— 懸浮細(xì)胞 葉 —— 花瓣 葉 —— 懸浮細(xì)胞 葉 —— 懸浮細(xì)胞 懸浮細(xì)胞 —— 懸浮細(xì)胞 葉 —— 根 懸浮細(xì)胞 —— 葉 原生質(zhì)體 —— 血紅細(xì)胞 懸浮細(xì)胞 —— 葉 懸浮細(xì)胞 —— 葉 腹水癌細(xì)胞 —— 原生質(zhì)體 葉 —— 根尖 纖維肉瘤細(xì)胞 —— 畸胎瘤細(xì)胞 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 幾種細(xì)胞融合成功的例子 植物融合細(xì)胞成長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)比 ,右瓶為地面融合的細(xì)胞，左瓶中為太空微重力環(huán)境下融合的細(xì)胞 動(dòng)物細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)使用的小白鼠 動(dòng)植物細(xì)胞的融合過(guò)程 植物細(xì)胞融合過(guò)程 人造小鼠培育過(guò)程示意圖 細(xì)胞融合的意義 ?理論上說(shuō)任何細(xì)胞，都有可能通過(guò)體細(xì)胞雜交而成為新的生物資源。 ?1975年 Kohler和 Milstein成功地融合了小鼠 B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞而產(chǎn)生能分泌預(yù)定單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。 ?1958年日本學(xué)者岡田（ Okada）發(fā)現(xiàn)仙臺(tái)病毒具有觸發(fā)動(dòng)物細(xì)胞融合的效應(yīng)。 細(xì)胞融合概述 細(xì)胞融合（ cell fusion)， 又稱體細(xì)胞雜交（ somatic hybridiazation），是指兩個(gè)或更多個(gè)相同或不同細(xì)胞通過(guò)膜 融合形成單個(gè)細(xì)胞的過(guò)程。 的條件 pH 應(yīng)該加入哪些物質(zhì)？這些物質(zhì)如何調(diào)配？ 在使用合成培養(yǎng)基時(shí)通常需加入血清、血漿等天然成分，目的是什么？ ? 蛋白質(zhì)生物制品的生產(chǎn) 如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體 ? 健康細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)健康細(xì)胞用于燒傷病人皮膚移植 ? 細(xì)胞的生理、藥理、病理研究 用于篩選抗癌藥物 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 條件要求 : 工藝方式 :分批 流加式 半連續(xù)式 連續(xù)式 培養(yǎng)技術(shù) : 懸浮培養(yǎng)技術(shù) 貼壁培養(yǎng)技術(shù) 微載體培養(yǎng)技術(shù) 多孔載體培養(yǎng)技術(shù) 微囊化培養(yǎng)技術(shù) 中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 植物組織培養(yǎng)和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的比較 比較項(xiàng)目 植物組織培養(yǎng) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 原理 培養(yǎng)基性質(zhì) 培養(yǎng)基特有成分 培養(yǎng)結(jié)果 培養(yǎng)目的 細(xì)胞的全能性 細(xì)胞增殖 固體培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基 蔗糖 植物激素 葡萄糖 動(dòng)物血清 植物體 細(xì)胞株、細(xì)胞系 快速繁殖、培育無(wú)病毒植株 獲得細(xì)胞或細(xì)胞分泌蛋白 思考： 為什么選用動(dòng)物胚胎或幼齡個(gè)體的器官或組織做動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)材料？ 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液的主要成分是什么？較植物組培培養(yǎng)基有何獨(dú)特之處？ 為什么培養(yǎng)前要將組織細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞？ 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)能否像綠色植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)成新個(gè)體？ 主要成分：葡萄糖、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、維生素和動(dòng)物血清等。 酒精燈置于中央，打開(kāi)的培養(yǎng)液、培養(yǎng)瓶等應(yīng)保持斜立或平放（瓶口長(zhǎng)時(shí)間開(kāi)口直立 ,易增加落菌機(jī)會(huì)）。 ? 吸取營(yíng)養(yǎng)液后的吸管不能再經(jīng)火焰燒灼 ,否則會(huì)燒焦形成炭膜 ,再用時(shí)會(huì)將有害物質(zhì)帶入培養(yǎng)液。 注意金屬器械不能在火焰上燒灼時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。 ?洗手 操作時(shí)因整個(gè)前臂伸入工作臺(tái)內(nèi)，所以洗手一定要刷洗到肘部，然后用 %新潔爾滅或 75%的酒精棉球擦拭。 無(wú)菌操作的要領(lǐng) ? 由于體外培養(yǎng)的細(xì)胞缺乏機(jī)體抗感染功能，所以在一切操作中要努力作到最大限度的無(wú)菌，防止污染。 ?洗刷消毒間： 烤箱、消毒鍋、蒸餾水處理器及酸缸等。 ?細(xì)胞冷凍貯存器 細(xì)胞冷凍貯存具有經(jīng)濟(jì)、省力和較好保持細(xì)胞生物學(xué)特性的優(yōu)點(diǎn)，目前各實(shí)驗(yàn)室主要使用液氮容器貯存細(xì)胞。 過(guò)濾裝置 ?各種培養(yǎng)用液只能用過(guò)濾的方法進(jìn)行除菌消毒處理。 ?水純化裝置 細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)水的質(zhì)量要求較高。 CO2培養(yǎng)箱的優(yōu)點(diǎn)在于能恒定地供應(yīng)一定量的 CO2,一般 5%即可 維持培養(yǎng)液 PH值穩(wěn)定 。 超凈工作臺(tái) ?也稱凈化工作臺(tái)，分為側(cè)流式、直流式和外流式三大類。風(fēng)淋室的板壁采用輕質(zhì)隔熱夾芯鋼板，吹淋板采用進(jìn)口不銹鋼制作，吹淋口方向可調(diào)，風(fēng)淋時(shí)間可在 3099秒間的調(diào)整。 ?操作間放置凈化工作臺(tái)及二氧化碳培養(yǎng)箱、離心機(jī)及倒置顯微鏡等。 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室 準(zhǔn)備室 風(fēng)淋 培養(yǎng)室 ?專用于組織細(xì)胞培養(yǎng)的空間，應(yīng)包括更衣間、緩沖間、操作間。細(xì)胞培養(yǎng)室和設(shè)計(jì)原則是防止微生物污染和有害因素影響，要求工作環(huán)境清潔、空氣清新，干燥和無(wú)煙塵。因此在進(jìn)行培養(yǎng)中，保持細(xì)胞生存環(huán)境無(wú)污染、代謝物及時(shí)清除等，是維持細(xì)胞生存的基本條件。 6)、無(wú)污染環(huán)境 ? 培養(yǎng)環(huán)境無(wú)毒和無(wú)菌是保證細(xì)胞生存的首要條件。 ?PH調(diào)整液： NaHCO3溶液、 HEPES溶液 （ 二羥乙基哌嗪乙烷磺酸 ） ?細(xì)胞消化液 : 胰蛋白酶溶液． EDTA溶液．膠原酶溶液 ?抗生素溶液： 1)青、鏈霉素 :每毫升培養(yǎng)液含 100U青霉素和100ug鏈霉素 . 2)卡那霉素：終濃度為 50ug/ml培養(yǎng)液。 無(wú)血清培養(yǎng)基不加動(dòng)物血清，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入細(xì)胞生長(zhǎng)有效因子，激素等。血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)很有效，但后期對(duì)培養(yǎng)產(chǎn)物的分離、提純以及檢測(cè)造會(huì)成一定困難。膠原是從動(dòng)物真皮中提取的，具改善細(xì)胞表面特性促使其附著生長(zhǎng)的作用。水解乳蛋白是乳白蛋白的水解產(chǎn)物，呈蛋黃色粉末狀，富含氨基酸。激素有胰島素、生長(zhǎng)激素和多種生長(zhǎng)因子如表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、增殖刺激因子(MSA)、類胰島素生長(zhǎng)因子 (IGFl、 IGF2)等。蛋白質(zhì)主要是白蛋白和球蛋白。牛血清分為 胎牛血清和犢牛血清 ，前者來(lái)源少，價(jià)格高；后者要求剛產(chǎn)下尚未哺乳的小牛，因?yàn)椴溉楹蟮男∨Ｑ逯锌赡芎懈鼜?fù)雜的成分。與合成培養(yǎng)基合用，能使細(xì)胞碩利增殖生長(zhǎng)。 使用最普遍的天然培養(yǎng)基是血清，基本以小牛血清最普遍。 ? 血清是天然培養(yǎng)基中最有效和最常用的培養(yǎng)成分。 ?人工合成培養(yǎng)基，如 109培養(yǎng)液、 DMEM、19 ? RPMI1640， IMEM， MEM培養(yǎng)液等。但與天然培養(yǎng)基相比，有些天然的未知成分尚無(wú)法用已知的化學(xué)成分所替代，因此，細(xì)胞培養(yǎng)中使用的基礎(chǔ)合成培養(yǎng)基還必須加入一定量的天然培養(yǎng)基成分，以克服合成培養(yǎng)基的不足。合成培養(yǎng)基的種類相當(dāng)多。 ?