【正文】 白質(zhì)改造方法，通常是從一個已知順序、結構和功能的蛋白質(zhì)出發(fā)，根據(jù)一定的目標和設計方案，使用多肽合成或者基因工程的方法，改變它的結構，以期達到改變其性質(zhì)的目的。 二、蛋白質(zhì)分子的高級改造（結構域的拼接） ?研究證明，在二級結構和三級結構之間還有一個結構層次，即 結構域 ?結構域由 α 螺旋、 β 折疊等二級結構單位按一定的拓撲學規(guī)則構成的三維結構實體。 利用定位突變在擬改造的氨基酸密碼兩側造成兩個原載體和基因上沒有的 內(nèi)切酶切點 ，用該內(nèi)切酶消化基因，再用合成的發(fā)生不同變化的雙鏈 DNA片段替代被消化的部分。 （三）隨機誘變技術 （四）盒式突變技術 ?常用方法：將基因克隆到質(zhì)粒上，旁邊有兩個緊密相連的限制性內(nèi)切酶位點，雙酶解后產(chǎn)生一個3′ 凹陷的末端和一個 5′ 凹陷的末端，與克隆基因想鄰的末端是 3′ 凹陷和 5′ 凹陷。 ?將兩管 PCR產(chǎn)物混合、變性、復性，則每條鏈會與另一管中的互補鏈退火，形成有兩個切口的環(huán)狀 DNA，轉入大腸桿菌后，這兩個切口均可被修復。 過程： ?將目的基因克隆到質(zhì)粒載體上，質(zhì)粒分置于兩管中，每管各加入兩個特定的 PCR引物，一個引物與基因內(nèi)部或其附近的一段序列完全互補，另一引物和另一段序列互補，但有一個核苷酸發(fā)生了突變； ?兩管中，不完全配對的引物與兩條相反的鏈結合，即兩個突變引物是互補的。分離出突變型基因后，在合適的表達系統(tǒng)中合成突變型蛋白質(zhì)。再轉入合適的表達系統(tǒng)合成突變型蛋白質(zhì)。 （一） M13DNA寡聚核苷酸介導誘變技術 特點： 能夠準確按照人們的意圖進行 DNA突變，即想改變哪一個堿基就只改變哪一個，其他的不變 基本過程： 將待研究的基因插入載體 M13，制得單鏈模板，人工合成一段寡核苷酸（其中含一個或幾個非配對堿基）作為引物，合成相應的互補鏈，用 T4連接酶連接成閉環(huán)雙鏈分子。 ?基因定位突變的基本過程 ： 首先使目的基因由環(huán)狀載體折成單鏈，再對指定的位點用寡聚核苷酸誘導或置入合成的寡聚核苷酸產(chǎn)生定位突變基因，最后將突變基因?qū)脒m宜的表達系統(tǒng)(如大腸桿菌等 )即可產(chǎn)生突變體蛋白質(zhì)。 ?基因定位突變 根據(jù)三聯(lián)體密碼，編碼 DNA（目的基因）的確定位點，改變其組成核苷酸的順序或種類，使基因發(fā)生定向變異，使其控制合成的氨基酸種類、順序發(fā)生改變，合成出具有預期氨基酸序列的修飾蛋白質(zhì)。 第三節(jié) 、 蛋白質(zhì)改造方法 在基因水平上對蛋白質(zhì)進行改造，按改造的規(guī)模和程度可以分為： 初級改造： 個別氨基酸的改變和一整段氨基酸序列的刪除、置換或插入 高級改造 ：蛋白質(zhì)分子的剪裁，如結構域的拼接 從頭設計合成新型蛋白質(zhì) 一、 初級改造 ?通過 基因突變方法 ，以達到改變氨基酸進而改造蛋白質(zhì)的目的。插入六聚體接頭后，在原蛋白質(zhì)序列中添加兩個氨基酸，比插入更多的氨基酸對蛋白質(zhì)整體功能的破壞要輕。 構建兩個同源蛋白的嵌合體時，應盡量使其接合部位處在具有相同或相近功能的氨基酸序列中；而當兩個非同源蛋白組成嵌合體時，則應使接合部分盡量位于所預測結構的邊緣。 應注意保留潛在的 N糖基化位點 (AsnXSer／ ThrXPro)中的 Asn(天門冬酰胺 )、 Set(絲氨酸 )或 Thr(蘇氨酸 )。 進行定點突變時，應注意保守氨基酸殘基。 (4)圍繞這些關鍵的基團和結構提出對蛋白質(zhì)進行改造的方案，并用基因工程的方法去實施。 （ 2）對目的蛋白的功能作詳盡的研究，確定它的功能域。這是目前蛋白質(zhì)工程研究的主體，它包括蛋白質(zhì)三維結構模型的建立，酶催化的性質(zhì)、蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性研究等 . 第三，從混雜變異體庫中篩選具有特定結構 功能關系的蛋白質(zhì)。 血紅蛋白中四亞基兩兩相同，分別稱為 α1 、 α β β2 蛋白質(zhì)工程主要包括 4大類研究 ： 第一，利用已知的蛋白質(zhì)一級結構的信息開發(fā)應用研究。 這些多肽鏈之間只是通過疏水作用等次級鍵結合成為有序排列的特定的空間結構，形成了四級結構。 疏水作用是維持蛋白質(zhì)高級結構的 重要因素 （ 5） 二硫鍵： 作用很強 ， 對穩(wěn)定蛋白質(zhì)構象起重要作用 ?氫鍵 、 離子鍵 、 疏水作用和范德華力等次級鍵是非共價鍵 ?肽鍵 、 二硫鍵 、 酯鍵等被稱之為共價鍵 蛋白質(zhì)二級結構 二級結構是指多肽鏈借助于氫鍵沿一維方向排列成具有周期性結構的構象，是多肽鏈局部的空間結構（構象） 主要形式： α 螺旋 、 β 折疊 、 β 轉角 、 無規(guī)卷曲 等 β轉角 蛋白質(zhì)分子的二級結構 α螺旋 β折疊片 β轉角 自由回轉 三級結構 三級結構是指整條多肽鏈在二級結構的基礎上 進一步盤曲而成特定格式的三級結構。 對蛋白質(zhì)分子三維構象的穩(wěn)定 貢獻不是很大 ， 也稱為離子鍵或鹽鍵 （ 3） 范德華力： 原子團相互接近時誘導所致 。 對蛋白質(zhì)分子三維構象的維護很重要 。 每一種蛋白質(zhì)分子都有自己特有的氨基酸的組成和排列順序即一級結構，由這種氨基酸排列順序決定它的特定的空間結構，也就是蛋白質(zhì)的一級結構決定了蛋白質(zhì)的二級、三級等高級結構 。 簡稱 N端 羧基末端： 多肽鏈中含有自由 α 羧基的一端。 氨基酸由于形成肽鍵而失去了一分子水，因此表現(xiàn)出其分子的不完整。 決定蛋白質(zhì)這種特殊生物功能的關鍵因素是它的分子構象 。當然，隨著 蛋白質(zhì)工程 的發(fā)展，其 成果也會應用到酶工程中，使酶工程成為蛋白質(zhì)工程的一部分 。 通常所說的 酶工程是用工程菌生產(chǎn)酶制劑 ，而沒有經(jīng)過由酶的功能來設計酶的分子結構，然后由酶的分子結構來確定相應基因的堿基序列等步驟。概括地說，酶工程是由酶制劑的生產(chǎn)和應用兩方面組成的。因此，它的產(chǎn)品已不再是天然的蛋白質(zhì)，而是經(jīng)過改造的、具有了人類所需要的優(yōu)點的蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)工程自誕生之日起，就 與基因工程密不可分 。 基因工程 是通過基因操作把外源基因轉入適當?shù)纳矬w內(nèi)，并在其中進行表達，它 的產(chǎn)品是 該基因編碼的 天然存在的蛋白質(zhì) 。 蛋白質(zhì)工程是指通過蛋白質(zhì)化學、蛋白質(zhì)晶體學和動力學的研究，獲取有關蛋白質(zhì)物理和化學等各方面的信息，在此基礎上利用生物技術手段對蛋白質(zhì)的DNA編碼序列進行有目的的改造并分離、純化蛋白質(zhì)，從而獲取自然界沒有的、具有優(yōu)良性質(zhì)或適用于工業(yè)生產(chǎn)條件的全新蛋白質(zhì)的過程。蛋白質(zhì)工程的實踐依據(jù) DNA指導合成蛋白質(zhì)，因此，人們可以根據(jù)需要對負責編碼某種蛋白質(zhì)的基因進行重新設計，使合成出來的蛋白質(zhì)的結構變得符合人們的要求。 ?蛋白質(zhì)工程就是以蛋白質(zhì)的結構與功能為基礎，利用基因工程的手段，按照人類自身的需要，定向地改造天然的蛋白質(zhì)，甚至創(chuàng)造新的、自然界本不存在的、具有優(yōu)良特性的蛋白質(zhì)分子。這也是生物彼此間存在親緣關系的證據(jù)之一 。 密碼子： U C A U G A U U A mRNA 密碼子 密碼子 密碼子 mRNA上決定一個氨基酸的三個相鄰堿基 密碼子總數(shù)： 43=64種 (其中 61種密碼子是對應氨基酸 和起始；另有 3個不對應氨基酸，只對應終止 ) 1種密碼子只對應 1種氨基酸； 1種氨基酸可以對應多種密碼子。再根據(jù)堿基互補配對規(guī)律推出脫氧核苷酸序列 。 ３、 蛋白質(zhì)工程的基本途徑 預期的蛋白質(zhì)功能 設計預期的蛋白質(zhì)結構 推測應有的氨基酸序列 找到相對應的脫氧核苷酸序列 （基因） 討論：某多肽鏈的一段氨基酸序列是： … —丙氨酸 —色氨酸 —賴氨酸 —甲硫氨酸 —苯丙氨酸 —… （ 1）怎樣得出決定這一段肽鏈的脫氧核苷酸序列？請把相應的堿基序列寫出來。 補充和完善之處： A： RNA作為遺傳物質(zhì)能自我復制 ， 并作為 mRNA指導PRO的合成 。