【正文】 胚 ” ； ? 13頭代孕母親； ? 1996年 7月 5日 ，羊羔 6LL3， 被命名為 “ 多莉 ” 。 （三）脾細(xì)胞的制備 (1)引頸處死小鼠，用酒精消毒體表； (2)無(wú)菌條件下取出脾臟，剃除結(jié)締組織和脂肪，用 5ml無(wú)血清培養(yǎng)液沖洗一次； (3)把脾臟置于已消毒的 90一 100目不銹鋼網(wǎng)或尼龍紗網(wǎng)中； (4)在脾中部切開(kāi)一小口，用注射器芯從一端輕輕壓擠，再用無(wú)血清培養(yǎng)液沖洗， 令細(xì)胞通過(guò)紗網(wǎng)，收集入平皿中，或用注射器向脾臟內(nèi)注入 3ml無(wú)血清培養(yǎng) 液，反復(fù)抽吸數(shù)次方法獲取細(xì)胞，再制成細(xì)胞懸液亦可； (5)把細(xì)胞懸液注入 50ml離心管中，加 l0一 20ml培養(yǎng)液：輕輕吹打數(shù)次，室溫中 置 5分鐘； (6)離心 (800一 1000轉(zhuǎn)／分 )計(jì)數(shù)、備用。另一條途徑是利用已存在的堿基，經(jīng)特異的磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶催化合成核苷酸，如 次黃嘌呤經(jīng)過(guò)次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（ HGPRT） 轉(zhuǎn)變?yōu)猷堰屎塑账帷? B淋巴細(xì)胞與抗體 １． B淋巴細(xì)胞受抗原刺激后，可以產(chǎn)生抗體。 ?親本二：高溫敏感突變型，但不能抗卡娜霉素。 ?例如粉蘭煙草與朗氏煙草細(xì)胞原生質(zhì)體均需外源激素才能生長(zhǎng)，但其融合細(xì)胞可以產(chǎn)生內(nèi)源激素，在培養(yǎng)基上不需加激素。 電融合法的優(yōu)點(diǎn)： ?融合率高、重復(fù)性強(qiáng)、對(duì)細(xì)胞傷害小； ?裝置精巧、方法簡(jiǎn)單、可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過(guò)程； ?免去 PEG誘導(dǎo)后的洗滌過(guò)程、誘導(dǎo)過(guò)程可控性強(qiáng)。 ?通常用分子量低于 1000的 PEG作融合劑最好， 50％ PEG溶液能產(chǎn)生最多雜交細(xì)胞。 ?淋巴細(xì)胞雜交瘤和單克隆抗體的制備。 ?1958年日本學(xué)者岡田（ Okada）發(fā)現(xiàn)仙臺(tái)病毒具有觸發(fā)動(dòng)物細(xì)胞融合的效應(yīng)。 ? 吸取營(yíng)養(yǎng)液后的吸管不能再經(jīng)火焰燒灼 ,否則會(huì)燒焦形成炭膜 ,再用時(shí)會(huì)將有害物質(zhì)帶入培養(yǎng)液。 ?洗刷消毒間： 烤箱、消毒鍋、蒸餾水處理器及酸缸等。 CO2培養(yǎng)箱的優(yōu)點(diǎn)在于能恒定地供應(yīng)一定量的 CO2,一般 5%即可 維持培養(yǎng)液 PH值穩(wěn)定 。 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室 準(zhǔn)備室 風(fēng)淋 培養(yǎng)室 ?專用于組織細(xì)胞培養(yǎng)的空間，應(yīng)包括更衣間、緩沖間、操作間。 ?PH調(diào)整液： NaHCO3溶液、 HEPES溶液 （ 二羥乙基哌嗪乙烷磺酸 ） ?細(xì)胞消化液 : 胰蛋白酶溶液． EDTA溶液．膠原酶溶液 ?抗生素溶液： 1)青、鏈霉素 :每毫升培養(yǎng)液含 100U青霉素和100ug鏈霉素 . 2)卡那霉素：終濃度為 50ug/ml培養(yǎng)液。水解乳蛋白是乳白蛋白的水解產(chǎn)物，呈蛋黃色粉末狀，富含氨基酸。與合成培養(yǎng)基合用，能使細(xì)胞碩利增殖生長(zhǎng)。但與天然培養(yǎng)基相比，有些天然的未知成分尚無(wú)法用已知的化學(xué)成分所替代，因此，細(xì)胞培養(yǎng)中使用的基礎(chǔ)合成培養(yǎng)基還必須加入一定量的天然培養(yǎng)基成分，以克服合成培養(yǎng)基的不足。氧氣參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生供給細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的能量和合成細(xì)胞生長(zhǎng)所需用的各種成分。 1） 恒定的溫度 :37 ℃ ， ? 維持培養(yǎng)細(xì)胞旺盛生長(zhǎng)，必須有恒定適宜的溫度。對(duì)環(huán)境適應(yīng)性差，對(duì)環(huán)境敏感，包括：PH、溶解氧、溫度、剪切力等比微生物要求更高。此后，在許多科學(xué)家的不懈努力下，動(dòng)物組織培養(yǎng)不斷改進(jìn)并逐漸發(fā)展成為動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。值得一提的是，這只小白鼠的背上，竟長(zhǎng)著一只幾乎與身子一般大小的 “ 人耳 ” 。 植物細(xì)胞培養(yǎng)基的組成 植物生長(zhǎng)激素 大多數(shù)植物細(xì)胞培養(yǎng)基中都含有天然的或合成的植物生長(zhǎng)激素 。 細(xì)胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn) 紅豆杉與紫杉醇 人參皂甘的生產(chǎn) 植物細(xì)胞培養(yǎng)是指在離體條件下將愈傷組織或其他易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中 ， 將組織振蕩分散成游離的懸浮細(xì)胞 ， 通過(guò)繼代培養(yǎng)使細(xì)胞增殖來(lái)獲得大量細(xì)胞群體的方法 。嚴(yán)格控制無(wú)菌條件，這是獲得培養(yǎng)成功的重要一步。第五章 細(xì) 胞 工 程 及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用 細(xì)胞工程 (cell engineering)是以細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)為基礎(chǔ)理論，采用原生質(zhì)體、細(xì)胞或組織培養(yǎng)等試驗(yàn)方法或技術(shù)，在細(xì)胞水平上研究改造生物遺傳特性，以獲得具有新的性狀的細(xì)胞系或生物體以及生物的次生代謝產(chǎn)物，并發(fā)展有關(guān)理論和技術(shù)方法的學(xué)科。 ②用一定的化學(xué)藥劑，最常用的有次氯酸鈉，升汞和酒精等對(duì)外植體表面消毒，建立無(wú)菌培養(yǎng)體系。 異想天開(kāi) 植物細(xì)胞工程的實(shí)際應(yīng)用 ?繁殖植物的新途徑 ? 微型育種 ? 作物脫毒 ? 人工種子 ?育種新方法 ? 單倍體育種 ? 誘導(dǎo)突變體 ?細(xì)胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn) 概念： 應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)，快速繁殖植物（也叫快速繁殖技術(shù)） 原理： 植物細(xì)胞的全能性 優(yōu)點(diǎn)： 繁殖率高，可大批量生產(chǎn) 取材少 培養(yǎng)周期短 保持優(yōu)良性狀 微型繁殖 作物脫毒 ?病毒在作物體內(nèi)逐年積累，會(huì)導(dǎo)致作物產(chǎn)量降低，品質(zhì)變差 ?分生區(qū)附近（莖尖、根尖）的病毒極少，甚至沒(méi)有 ?采用莖尖進(jìn)行組織培養(yǎng) 人工種子 ? 結(jié)構(gòu)： ? 人工薄膜 +胚狀體（不定芽、頂芽、腋芽） ? 優(yōu)點(diǎn)： ? 不受氣候、季節(jié)、地域的限制 ? 保留優(yōu)良性狀 ? 時(shí)間短，占地少 ? 技術(shù)： ? 組織培養(yǎng) ? 原理： ? 細(xì)胞全能性 ? 養(yǎng)分、無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)碳源、農(nóng)藥、抗生素、有益菌 ? 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑 單倍體育種 ? 方法： ? 花藥離體培養(yǎng) ? 技術(shù)： ? 組織培養(yǎng)獲得單倍體 ? 秋水素處理單倍體的幼苗，使染色體加倍 ? 優(yōu)點(diǎn)： ? 明顯縮短了育種年限 ? 后代穩(wěn)定遺傳 突變體的利用 ?利用組織培養(yǎng)時(shí)，分裂狀態(tài)的細(xì)胞易受培養(yǎng)條件和外界壓力（如射線，化學(xué)物質(zhì)等）的影響而產(chǎn)生突變的原理，誘導(dǎo)并篩選出對(duì)人類有用的突變體。 原生質(zhì)體培養(yǎng) 通常需要大多數(shù)必需維生素 。 動(dòng)物細(xì)胞工程 應(yīng)用 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 動(dòng)物細(xì)胞融合 單克隆抗體技術(shù) 核移植 動(dòng)物細(xì)胞工程常用技術(shù) 人耳鼠 “人耳鼠 ” 再出風(fēng)頭 2022年，一只特別的活老鼠在北京引起轟動(dòng) ——這是有著一對(duì)紅眼睛的、尾巴長(zhǎng)長(zhǎng)的、渾身沒(méi)毛的小白鼠。哈里森的實(shí)驗(yàn)不僅解決了神經(jīng)纖維的起源問(wèn)題，而且開(kāi)創(chuàng)了動(dòng)物組織培養(yǎng)的先河。 動(dòng)物組織細(xì)胞培養(yǎng)要求 一 體外培養(yǎng)特點(diǎn) : 大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞要附在物體上表面生長(zhǎng)，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求更嚴(yán)格，除氨基酸、維生素、鹽類、葡萄糖外，還需要血清。 ？ 提示：無(wú)菌、無(wú)毒的環(huán)境。 ?氣體是人體細(xì)胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體 主要有氧氣和二氧化碳 。合成培養(yǎng)基成分已知，便于對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的控制。血清由于含有多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子、促貼附因子及其多活性物質(zhì)。 ? 水解乳蛋白、膠原 是另外兩種較好的天然培養(yǎng)基成分。 5) 細(xì)胞 培養(yǎng)溶液 ?平衡鹽水（ BSS）： Hanks 液和 Earle液是常用的 BSS基礎(chǔ)溶液。 ?細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)計(jì)實(shí)施原則一般是無(wú)菌操作區(qū)設(shè)在室內(nèi)較少走動(dòng)的內(nèi)側(cè)，常規(guī)操作和封閉培養(yǎng)于一室，而洗刷消毒在另一室。 CO2培養(yǎng)箱 ? 哺乳動(dòng)物離體細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)細(xì)胞一樣 ,需要在恒足溫度下才能生存 ,溫差變化一般不應(yīng)超過(guò) ，因此培養(yǎng)箱對(duì)溫度應(yīng)具有較高靈敏度。 ?培養(yǎng)器皿 培養(yǎng)器皿包括各種規(guī)格的玻璃、塑料培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿，吸管，離心管等。 ?燒過(guò)的用具均要待冷卻后再接觸組織細(xì)胞。 細(xì)胞融合的定義 Cienkawski(1876)、 Buck(1877)、 Geddes(1880)在無(wú)脊椎動(dòng)中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞合并現(xiàn)象。 ?體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜種細(xì)胞含有來(lái)自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分 裂和增殖過(guò)程中雙親的葉綠體、線粒體 DNA亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新 的核外遺傳系統(tǒng)。 ?PEG經(jīng)高壓滅菌后，與溫?zé)岬?Engle氏液混合。 三、電融合法 電融合法是 80年代出現(xiàn)的細(xì)胞融合技術(shù)，在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，細(xì)胞膜表面的氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細(xì)胞粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而質(zhì)膜開(kāi)始連接，直到閉和成完整的膜，形成融合體。 親本 1：用異硫氰酸熒光素染色原生質(zhì)體 親本 2：葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體 在熒光顯微鏡下，親本 1為紅色，親本 2為綠色，雜種細(xì)胞可以區(qū)分 ?4） 利用生長(zhǎng)特性篩選法： 利用原生質(zhì)體對(duì)培養(yǎng)基成分要求與反應(yīng)的差異選擇雜種細(xì)胞。 ?親本一：具有卡那霉素抗性但只能在 37度左右生長(zhǎng)。 B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體。細(xì)胞有兩條基本途徑合成嘌呤核苷酸，一條是從磷酸核糖、氨基酸、CO2和 NH3等化合物開(kāi)始，葉酸是重要的輔酶，而 氨甲蝶呤 是葉酸的拮抗劑，可阻斷瘤細(xì)胞通過(guò)這一途徑合成核苷酸。對(duì)于細(xì)胞性抗原不用佐劑，每次腹腔注射 1 l06一 1 107。另外，用單克隆抗體做體內(nèi)診斷，借以鑒別和定位體內(nèi)“病灶”也引起人們的注意，目前，主要用于腫瘤追蹤及心肌梗塞的診斷。 。 ?在能源、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域的應(yīng)用