【正文】 動(dòng)物細(xì)胞特點(diǎn)？ ?分化潛能變窄 ：隨著細(xì)胞分化程度的提高而逐漸受到限制，分化潛能變窄，這是指整體細(xì)胞而言。一般來(lái)講可溶性抗原用完全佐劑效果較好。 ? 目標(biāo)：地上和地下部兼用種、固氮禾等 具有兩種不同優(yōu)勢(shì)性狀的新品種 。 ? 如親本 1：葉綠體缺陷型 親本 2：光致死型 兩親本在光照下一種死亡，另一種呈白 色，融合細(xì)胞長(zhǎng)成植株呈綠色，并能成長(zhǎng) ?2） 抗性互補(bǔ)篩選法： 利用親本細(xì)胞原生質(zhì)體對(duì)抗生素、除草劑及其它有毒物質(zhì)抗性差異選擇雜種細(xì)胞。 ?聚乙二醇 (PEG)結(jié)構(gòu)為： HOH2C（ CH20CH2） nCH2OH，分子量大于 200小于 6000者均可用作細(xì)胞融合劑。獨(dú)特之處有： 液體培養(yǎng)基 成分中有動(dòng)物血清等 因?yàn)檫@些組織或器官上的細(xì)胞生命力旺盛，分裂能力強(qiáng) 成塊組織不利培養(yǎng)，分散了做成細(xì)胞懸浮液利于培養(yǎng) 不能，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)只能使細(xì)胞數(shù)目增多，不能發(fā)育成新的動(dòng)物個(gè)體 3）細(xì)胞融合技術(shù)（體細(xì)胞雜交技術(shù)） 細(xì)胞融合是正常的生命活動(dòng) 兩個(gè)細(xì)胞正在融合 受精作用 動(dòng)物細(xì)胞融合 細(xì)胞 A 細(xì)胞 B 雜種細(xì)胞 滅活的病毒 物理法 化學(xué)法 仙臺(tái)病毒 皰疹病毒 新城雞瘟病毒 用滅活的病毒誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合過(guò)程 細(xì)胞核 病毒顆粒 細(xì)胞核 細(xì)胞融合與融合誘導(dǎo)細(xì)胞融合物質(zhì) 誘導(dǎo)劑： 仙臺(tái)病毒 聚乙二醇 電融合 誘導(dǎo)細(xì)胞融合的仙臺(tái)病毒必須滅活。微化濾膜濾器是目前應(yīng)用最廣泛的過(guò)濾裝置。 四 細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)施 實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì) 細(xì)胞培養(yǎng)是一種無(wú)菌操作技術(shù)，要求工作環(huán)境和條件必須 保證無(wú)微生物污染 和不受其它有害因素的影響。 ?氨基酸是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的基本成分，氨基酸中有 12種是細(xì)胞本身不合成的，必須由培養(yǎng)液提供。 合成 培養(yǎng)基 ? 1951年厄爾開(kāi)發(fā)了供動(dòng)物細(xì)胞體外生長(zhǎng)的人工合成培養(yǎng)基 (MEM)。 ? ? 三 、 培養(yǎng)條件 細(xì)胞在體外培養(yǎng)中所需的條件 與體內(nèi)細(xì)胞基本相同。 1907年，美國(guó)生物學(xué)家哈里森 (Harrison)從蝌蚪的脊索中分離出神經(jīng)組織，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培養(yǎng)。 碳源和能源 維生素 植物細(xì)胞的生長(zhǎng)都需要硫胺素 。 受精卵的全能性最高； 其次是生殖細(xì)胞（尤其是卵細(xì)胞）； 體細(xì)胞的全能性比生殖細(xì)胞低得多。 1）植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù) 植物組織培養(yǎng)的過(guò)程 離體的植物器官、組織或細(xì)胞 脫分化（又叫去分化） 愈傷組織 （排列疏松而無(wú)規(guī)則，高度液泡化的呈無(wú)定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞） 再分化 根或芽等器官 植物體 植物組織培養(yǎng)的條件： 適宜的養(yǎng)料和激素，適宜的溫度和無(wú)菌條件 離體的植物器官、組織或細(xì)胞 愈傷組織 根 芽 植物體 脫分化 再分化 脫分化 由高度分化的植物器官、組織或細(xì)胞產(chǎn)生愈傷組織的過(guò)程，稱為植物細(xì)胞的脫分化。 有機(jī)氮源 通常采用的有機(jī)氮源有 蛋白質(zhì)水解物 、 谷氨酰胺或氨基酸混合物 等 。 （分解彈性纖維） 有關(guān)概念 ?原代培養(yǎng) ：從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞為原代細(xì)胞。 ℃ ，偏離這一溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝會(huì)受到影響，甚至死亡。 ?人工合成培養(yǎng)基，如 109培養(yǎng)液、 DMEM、19 ? RPMI1640， IMEM， MEM培養(yǎng)液等。膠原是從動(dòng)物真皮中提取的，具改善細(xì)胞表面特性促使其附著生長(zhǎng)的作用。 ?操作間放置凈化工作臺(tái)及二氧化碳培養(yǎng)箱、離心機(jī)及倒置顯微鏡等。 無(wú)菌操作的要領(lǐng) ? 由于體外培養(yǎng)的細(xì)胞缺乏機(jī)體抗感染功能，所以在一切操作中要努力作到最大限度的無(wú)菌，防止污染。 ?1975年 Kohler和 Milstein成功地融合了小鼠 B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞而產(chǎn)生能分泌預(yù)定單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。 二、聚乙二醇（ PEG）法 聚乙二醇（ PEG）法細(xì)胞融合過(guò)程 ?PEG的作用機(jī)理 ： Kao等認(rèn)為，由于 PEG分子具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成 H鍵，從而在在質(zhì)膜之間形成分子橋，其結(jié)果是使細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生粘連進(jìn)而促使質(zhì)膜的融合；另外， PEG能增加類脂膜的流動(dòng)性，也使細(xì)胞的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。 ?親本 A：對(duì)氨芐青霉素敏感，對(duì)卡娜霉素不敏感 ?親本 B：對(duì)卡娜霉素敏感，對(duì)氨芐青霉素不敏感 ?雜種細(xì)胞可以在含有兩種抗生素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng) ?2） 營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)篩選系統(tǒng)： 細(xì)胞在缺乏一種或幾種營(yíng)養(yǎng)成分時(shí)，不能生長(zhǎng)繁殖，即營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞。 ３．每一個(gè)淋巴細(xì)胞只能產(chǎn)生一種抗體。 （五）細(xì)胞融合 (1)將 1ml 40％的 PEG液一滴滴加入列細(xì)胞團(tuán)中，在 60秒內(nèi)加完，同時(shí)并不斷輕微 轉(zhuǎn)動(dòng)離心管或用手指輕彈離心管； (2)在不斷轉(zhuǎn)動(dòng)離心管中加 1ml無(wú)血清培養(yǎng)液， 60秒鐘內(nèi)加完； (3)于 5分鐘內(nèi)慢慢加完 20ml無(wú)血清培養(yǎng)液；此時(shí)細(xì)胞對(duì)機(jī)械損傷非常敏感， (4)離心 (800轉(zhuǎn)／分， 8分鐘 )，去上清，用完全培養(yǎng)液 10ml懸浮，輕輕混勻； (5)取 96孔板，每孔加 50?l； (6)取等體積細(xì)胞懸液，向另一 96孔板中加 50P1； (7)送入 5％ CO2，溫箱中 37℃ 培養(yǎng)， 24小時(shí)后更換成 HAT選擇性培養(yǎng)掖。 ?新型動(dòng)植物品種的培育。 動(dòng)物體細(xì)胞核移植是一種無(wú)性繁殖技術(shù)，用核移植的方法得到的動(dòng)物稱為克隆動(dòng)物。免疫時(shí)是否采用佐劑和事先處理抗原，要依抗原性的強(qiáng)弱而定。 ? 一些近親植物、有性不親和的組合，如馬鈴薯 番茄等都得到了再生植株。 ? 6） 核質(zhì)體 ：有細(xì)胞核而帶有少量細(xì)胞質(zhì)的亞原生質(zhì)體 ?基于酶缺陷型細(xì)胞和藥物抗性所建立的雜種篩選 ?基于營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞所建立的雜種篩選 ?由溫度敏感型細(xì)胞組成的雜種細(xì)胞的篩選 ?具有所需性狀雜種細(xì)胞的篩選 常用的雜種細(xì)胞篩選方法 植物細(xì)胞篩選方式 1） 遺傳互補(bǔ)篩選法： 利用每一親本貢獻(xiàn)一個(gè)功能正常等位基因，糾正另一親本的缺陷，令雜種細(xì)胞表現(xiàn)正常。 用滅活的病毒誘導(dǎo)的動(dòng)物細(xì)胞融合過(guò)程示意圖 ? 優(yōu)點(diǎn)是易得，用法簡(jiǎn)單，融合效果穩(wěn)定。 的條件 pH 應(yīng)該加入哪些物質(zhì)？這些物質(zhì)如何調(diào)配？ 在使用合成培養(yǎng)基時(shí)通常需加入血清、血漿等天然成分，目的是什么？ ? 蛋白質(zhì)生物制品的生產(chǎn) 如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體 ? 健康細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)健康細(xì)胞用于燒傷病人皮膚移植 ? 細(xì)胞的生理、藥理、病理研究 用于篩選抗癌藥物 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 條件要求 : 工藝方式 :分批 流加式 半連續(xù)式 連續(xù)式 培養(yǎng)技術(shù) : 懸浮培養(yǎng)技術(shù) 貼壁培養(yǎng)技術(shù) 微載體培養(yǎng)技術(shù) 多孔載體培養(yǎng)技術(shù) 微囊化培養(yǎng)技術(shù) 中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 植物組織培養(yǎng)和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的比較 比較項(xiàng)目 植物組織培養(yǎng) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 原理 培養(yǎng)基性質(zhì) 培養(yǎng)基特有成分 培養(yǎng)結(jié)果 培養(yǎng)目的 細(xì)胞的全能性 細(xì)胞增殖 固體培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基 蔗糖 植物激素 葡萄糖 動(dòng)物血清 植物體 細(xì)胞株、細(xì)胞系 快速繁殖、培育無(wú)病毒植株 獲得細(xì)胞或細(xì)胞分泌蛋白 思考： 為什么選用動(dòng)物胚胎或幼齡個(gè)體的器官或組織做動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)材料？ 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液的主要成分是什么？較植物組培培養(yǎng)基有何獨(dú)特之處？ 為什么培養(yǎng)前要將組織細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞？ 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)能否像綠色植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)成新個(gè)體？ 主要成分：葡萄糖、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、維生素和動(dòng)物血清等。 過(guò)濾裝置 ?各種培養(yǎng)用液只能用過(guò)濾的方法進(jìn)行除菌消毒處理。因此在進(jìn)行培養(yǎng)中，保持細(xì)胞生存環(huán)境無(wú)污染、代謝物及時(shí)清除等，是維持細(xì)胞生存的基本條件。蛋白質(zhì)主要是白蛋白和球蛋白。 ? 動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基一般分為天然、合成、無(wú)血清培養(yǎng)基幾種，此外細(xì)胞培養(yǎng)還需要一些常用的溶液。 ? 根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞種類要求不同培養(yǎng)瓶的形態(tài)各異，用于細(xì)胞傳代培養(yǎng)的細(xì)胞要求瓶壁厚簿均勻，便于細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)和觀察，瓶口要大小一致，口徑一般不小于 1cm，允許吸管伸入瓶?jī)?nèi)任何部位。生物學(xué)家們就這個(gè)問(wèn)題展開(kāi)了激烈的爭(zhēng)論。 無(wú)機(jī)鹽類 包括： 無(wú)機(jī)鹽濃度一般為多少 ？ 微量元素主要包括碘 、 硼 、 錳 、 鋅 、 鉬 、 銅 、 鈷 、鐵等 。 在生物的個(gè)體發(fā)育中，由于基因在特定時(shí)間和空間下選擇性地表達(dá)而形成不同器官，因此，要實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的全能性，首先必須使生物體的細(xì)胞