【正文】 缺點(diǎn)：商品酶制 劑 均含有核酸酶、蛋白、 過氧化物酶以及 酚類 物 質(zhì) 。 會(huì) 影 響 所 獲 原生 質(zhì) 體的活力 。 常用的酶種類 纖維 素酶 類 （ 纖維 素酶、半 纖維 素酶、崩潰 酶 [Driselase]）、果 膠 酶 類 （果 膠 酶和離析酶 [Macerozyme]）、 蝸 牛酶和 胼胝質(zhì) 酶。 原生質(zhì)體的純化 原生質(zhì)體采用比原生 質(zhì) 體密度大的高滲溶液（蔗糖、 Percoll、 Ficoll）， 使原生 質(zhì) 體漂浮在液體表 層 的 純 化方法。 優(yōu) 點(diǎn)：可以 避免分離的原生 質(zhì) 體因震 蕩被 組織 碎片撞 擊 而破 損 ；所用 藥 品 簡單 ，成本低 。 缺點(diǎn)： 對(duì) 離心力要求比 較嚴(yán) 格，掌握不好，原生 質(zhì) 體 則 不易漂浮 。 飄浮法 沉降法（過濾－離心法） 利用比重原理，在具有一定滲透 壓 的溶液中，先 進(jìn) 行 過濾 然后低速離心，使 純凈 完整的原生 質(zhì) 體沉 積 于 試 管底部。 優(yōu) 缺點(diǎn)： 純 化原生 質(zhì) 體比 較 簡單 。 由于原生 質(zhì) 體沉 積 于 試 管底部，造成相互 擠壓 ，常引起原生 質(zhì) 體的破碎 。 1 2 m L碎片帶含原生質(zhì)體帶0 . 6 m L 0 . 4 5 M 蔗糖0 . 4 5 M甘露醇不連續(xù)梯度法 又 稱 界面法，采用 兩種 密度不同的溶液形成不 連續(xù)梯度，通 過 離心使 原生 質(zhì)體 與 破 損細(xì) 胞分 別處 于不同液相中 ， 從 而 純 化原生質(zhì) 體的方法。 優(yōu) 點(diǎn)：可以收集到 數(shù) 量 較大的 純凈 原生 質(zhì) 體，同 時(shí)避免收集 過 程中原生 質(zhì) 體因相互 擠壓 而破碎 。 原生質(zhì)體活力測定 －形態(tài)識(shí)別 形態(tài)完整、富含細(xì)胞質(zhì)、顏色新鮮的正常球形，放入低滲溶液中，可正常膨大。 形態(tài)識(shí)別 熒光顯微鏡識(shí)別 (FDA法 ) FDA (fluorescein diacetate) 不 發(fā)熒 光也不具有 極 性，能自由穿 過細(xì) 胞 質(zhì) 膜。活 細(xì) 胞內(nèi) FDA可以被 內(nèi)酯 酶水解 為 不能自由穿越 質(zhì) 膜的 熒 光素，在完整的活細(xì) 胞 內(nèi)積 累。 使用 濃 度： % 酚藏花紅染色法 酚藏花紅（ %) 能使無活力的原生質(zhì)體染成紅色，有活力的原生質(zhì)體不著色。 有活力但受損傷的細(xì)胞和死細(xì)胞能夠攝取伊凡藍(lán) (Evan’s blue)(%)這種染料，活細(xì)胞不攝取。 伊凡藍(lán)染色法 植物細(xì)胞融合 PEG法和 電 融合法比 較 合適 融合子的鑒別 根據(jù)兩親本原生質(zhì)體的形狀和結(jié)構(gòu)的差異來鑒別雜合體。如一方細(xì)胞基本無色，另一方為綠色，則白綠色結(jié)合的細(xì)胞就是雜合細(xì)胞 根據(jù)可見標(biāo)記性狀的機(jī)械選擇法 顯微鑒別 ?。 ? FITC(異 硫 氰 酸 熒光素 )在 熒 光 顯 徽 鏡下呈 綠 色 ? RITC (異 硫 氰 酸羅 丹明 ) 在 熒 光 顯 徽鏡 下呈 紅 色 熒光標(biāo)記 互 補(bǔ)選擇 法是指利用 兩個(gè)親 本具有不同 遺傳 和生理特性 ,在特定培 養(yǎng)條 件下 ,只有 發(fā) 生互 補(bǔ) 作用的 雜種細(xì) 胞才能生 長 的 選擇 方法。 互補(bǔ)選擇法 ? 代謝互補(bǔ) ： 利用兩種營養(yǎng)缺陷型或兩種抗性突變體的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，在同時(shí)缺陷兩種物質(zhì)或同時(shí)含有兩種有害物質(zhì)的培養(yǎng)基上篩選雜種細(xì)胞，能生長的細(xì)胞團(tuán)可以初步認(rèn)為由雜種細(xì)胞形成。 ? 生長互補(bǔ)： 雙親原生質(zhì)體的生長需要外源生長激素，而由雙親原生質(zhì)體融合后形成對(duì)生長激素自養(yǎng)的雜種細(xì)胞，能在無外源生長激素的培養(yǎng)基上生長。 原生質(zhì)體矮牽牛 爬山虎 冠 癭混合體矮牽牛 + 爬山虎細(xì)胞團(tuán)愈傷組織（異核體）細(xì) 胞 團(tuán)死亡愈傷組織原生質(zhì)體細(xì)胞團(tuán)死亡愈傷組織（異核體）（異核體）（異核體）（異核體）（異核體）（異核體）（異核體）愈傷組織愈傷組織細(xì)胞團(tuán)愈傷組織愈傷組織死亡細(xì)胞團(tuán)愈傷組織愈傷組織原生質(zhì)體死亡細(xì)胞團(tuán)愈傷組織愈傷組織矮牽牛 + 爬山虎原生質(zhì)體死亡細(xì)胞團(tuán)愈傷組織愈傷組織混合體矮牽牛 爬山虎原生質(zhì)體死亡細(xì)胞團(tuán)愈傷組織愈傷組織原生質(zhì)體混合體矮牽牛 爬山虎原生質(zhì)體死亡細(xì)胞團(tuán)愈傷組織愈傷組織矮牽牛原生質(zhì)體混合體矮牽牛 爬山虎原生質(zhì)體死亡細(xì)胞團(tuán)愈傷組織愈傷組織原生質(zhì)體混合體矮牽牛 + 爬山虎原生質(zhì)體死亡細(xì)胞團(tuán)愈傷組織愈傷組織細(xì) 胞 團(tuán)原生質(zhì)體混合體矮牽牛 爬山虎原生質(zhì)體死亡細(xì)胞團(tuán)愈傷組織愈傷組織愈傷組織細(xì) 胞 團(tuán)原生質(zhì)體混合體矮牽牛 爬山虎原生質(zhì)體死亡細(xì)胞團(tuán)愈傷組織愈傷組織死亡愈傷組織細(xì) 胞 團(tuán)原生質(zhì)體混合體矮牽牛 爬山虎原生質(zhì)體死亡細(xì)胞團(tuán)愈傷組織愈傷組織細(xì)胞團(tuán)死亡愈傷組織細(xì) 胞 團(tuán)混合體矮牽牛 爬山虎原生質(zhì)體死亡細(xì)胞團(tuán)愈傷組織愈傷組織細(xì)胞團(tuán)死亡愈傷組織混合體矮牽牛 爬山虎原生質(zhì)體死亡細(xì)胞團(tuán)愈傷組織愈傷組織矮牽牛MS培養(yǎng)基( 有激素 )MS培養(yǎng)基( 無激素 )NT 培養(yǎng)基融合處理MS培養(yǎng)基( 無激素 )NT 培養(yǎng)基NT 培養(yǎng)基MS 培養(yǎng)基( 無激素 )第四節(jié) 細(xì)胞拆合技術(shù)及其應(yīng)用 一、細(xì)胞拆合與重組的涵義 完整細(xì)胞 胞質(zhì)體 核質(zhì)體 微細(xì)胞小細(xì)胞? 胞質(zhì)體（ cytoplast）：除去細(xì)胞核后由膜包裹的無核細(xì)胞，由細(xì)胞松弛素 B處理后，經(jīng)離心得到。 ?核 質(zhì) 體（ karyoplast）：由胞 質(zhì) 體分離出 來的核， 帶 有少量胞 質(zhì)并圍 有 質(zhì) 膜的 結(jié)構(gòu) 。 ?微 細(xì) 胞：核 內(nèi) 染色體不完整的 細(xì) 胞 ? 將細(xì)胞核質(zhì)分離技術(shù)與細(xì)胞融合技術(shù)結(jié)合，在融合介質(zhì)作用下，使胞質(zhì)體與完整細(xì)胞合并，使胞質(zhì)體與完整細(xì)胞，或胞質(zhì)體與核質(zhì)體，或微細(xì)胞與完整細(xì)胞重新組成細(xì)胞的過程。 細(xì) 胞重 組 細(xì)胞重組的三種方式 ?胞 質(zhì) 體 與 完整 細(xì) 胞重 組 形成 細(xì) 胞 質(zhì)雜 交 細(xì) 胞 ?微 細(xì) 胞 與 完整 細(xì) 胞重 組 形成微 細(xì) 胞 異 核體。 ?胞 質(zhì) 體 與 核 質(zhì) 體重新 組 合形成重 組細(xì) 胞。 完整細(xì)胞 胞質(zhì)體 核質(zhì)體 微細(xì)胞小細(xì)胞 ? 3:親本細(xì)胞 。 6:核質(zhì)體 。 7:胞質(zhì)體 ? 9:雜種細(xì)胞 。 10:重組細(xì)胞 。 11:胞質(zhì)雜種細(xì)胞 ? 。 13微細(xì)胞異核體 1213三 種細(xì) 胞重組 的方式 1213? 把完整 細(xì) 胞的 細(xì) 胞核 與細(xì) 胞 質(zhì) 用特殊的方法分離 開來 （用紫外 線 等把 細(xì) 胞中的核 殺 死或把細(xì) 胞核 從細(xì) 胞 質(zhì) 中吸取出 來 ），然后再把同 種 或異種 的 細(xì) 胞核和 細(xì) 胞 質(zhì) 重新 組 合起 來 ，培育新的細(xì) 胞或新的生物 個(gè) 體。 細(xì) 胞拆合 二、細(xì)胞拆合的方法 ?物理拆合法：機(jī)械方法或短波光 ?化學(xué)拆合法：細(xì)胞松弛素 ?所 謂 核移植技 術(shù) 就是利用 顯 微操作技 術(shù)將 一 個(gè)細(xì) 胞的細(xì) 胞核移植到另一 個(gè)細(xì) 胞中，或者 將兩個(gè)細(xì) 胞的 細(xì) 胞核（或 細(xì) 胞 質(zhì) ） 進(jìn) 行交 換 ， 從 而可能 創(chuàng) 造無性 雜 交生物新品 種 的一 項(xiàng) 技 術(shù) 。 核移植技術(shù) 思考題 ：細(xì)胞融合、細(xì)胞重組、核移植、微細(xì)胞。原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、細(xì)胞系和細(xì)胞株、粘附型細(xì)胞、接觸抑制、有限細(xì)胞系和無限細(xì)胞系，愈傷組織、外植體、懸浮培養(yǎng)、植板率。 。 。 。 6. 大規(guī)模培養(yǎng)植物細(xì)胞的特點(diǎn)和主要的生物反應(yīng)器類型。 10. 融合子選擇的方法的方法和原理。