多糖分離純化及含量測(cè)定-資料下載頁(yè)
2025-05-15 01:59本頁(yè)面
【正文】 達(dá)到 10 %， 30 %， 45 %， 65 %， 進(jìn)行分級(jí)沉淀 ， 最后將剩余的母液直接蒸發(fā)濃縮 ， 得到 5 個(gè)分級(jí)的五味子多糖組分 。 三、多糖含量的測(cè)定方法 ? 多糖含量測(cè)定常規(guī)方法是以 無(wú)水葡萄糖為對(duì)照品 , 采用苯酚 硫酸法 , 或者蒽酮 硫酸法 。 ? 上述兩種方法由于操作簡(jiǎn)單 , 試劑容易獲得而在多糖含量測(cè)定中被廣泛采用 。 苯酚 硫酸法的原理 ? 多糖在硫酸存在下先水解成單糖 , 再脫水生成具有呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物 。 由 五碳糖生成的是糠醛 , 甲基五碳糖生成的是 5甲糠醛 , 六碳糖生成的是 5羥甲糠醛 。 糠醛酸在此條件下往往脫羧 , 并生成糠醛 。 糠醛及其衍生物和苯酚縮合成有色物質(zhì) , 在 480 nm 處有最大吸收 , 吸收值與糖的含量呈線性關(guān)系 。 蒽酮 硫酸法的原理 ? 蒽酮 硫酸法其原理是糖類與濃硫酸在沸水浴中迅速 脫水生成糠醛或其衍生物 , 再與蒽酮試劑縮合 , 形成藍(lán)綠色溶液 , 在 620 nm 處有最大吸收 , 吸收值與糖的含量呈線性關(guān)系 。 ? 這兩種方法也存在較為嚴(yán)重的缺陷 : ? 首先 , 葡萄糖是單糖 , 而植物多糖的組成是多樣的 , 只用葡萄糖作為參照不確切 。 ? 其次 , 顯色試劑的不專屬 , 單糖的干擾嚴(yán)重 , 實(shí)際上測(cè)得的結(jié)果是總糖的結(jié)果 。 在未嚴(yán)格純化的植物多糖樣品中 , 這種情況更為普遍 。 ? 為排除還原性單糖的干擾 , 可采用 DNS( 3, 5二硝基水楊酸 )比色法測(cè)定還原糖含量 。 其原理是在堿性溶液中 , 3, 5二硝基水楊酸與還原糖共熱后被還原成棕紅色氨基化合物 , 在一定范圍內(nèi)還原糖的量與反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度呈比例關(guān)系 。 ? 再將通過(guò)硫酸 苯酚法或者蒽酮 硫酸法得到的總糖結(jié)果減去還原糖 , 即得較準(zhǔn)確的多糖含量 。 糖醛酸含量測(cè)定 ? 糖醛酸含量測(cè)定則以 咔唑 硫酸法 多見(jiàn)。 ? 該法的原理在于糖醛酸在硫酸存在下會(huì)與 咔唑 反應(yīng)生成含羰基的紫紅色產(chǎn)物。該產(chǎn)物在 530 nm下有最大吸收 , 吸收值與糖含量呈線性關(guān)系。 四、純度與相對(duì)分子質(zhì)量的檢測(cè) ? 純度鑒定 ? 分子量的測(cè)定 ? 結(jié)構(gòu)測(cè)定 包括多糖一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定 、 多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定 純度鑒定 ? 多糖是高分子化合物 ， 其純品微觀上是不均一的 ， 通常所說(shuō)的多糖純品實(shí)質(zhì)上是一定分子量范圍的均一組分 。 ? 多糖純度鑒定的常用方法：超離心 、 高壓電泳 、 凝膠層析 、 HPLC 法等 。 ? 現(xiàn)在應(yīng)用較多的是 HPLC 法 ， 旋光度測(cè)定也是純度測(cè)定的一種方法 。 分子量的測(cè)定 ? 多糖分子量的測(cè)定是研究多糖性質(zhì)的一項(xiàng)重要工作 。 ? 常用方法：滲透壓法 、 蒸氣壓滲透劑法 、 端基法 、 粘度法 、 光散射法 、 凝膠色譜法 、 超過(guò)率法 、 沉淀法 、凝膠電泳法 、 HPLC 法 、 超離心分析法 、 分子篩色譜法 、 GPC（ 凝膠滲透色譜 ） 法 、 MALDI－ TOF－ MS （ 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 ） 法 。 結(jié)構(gòu)測(cè)定 —— 多糖一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定 ? 多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析 ， 主要是分析組成多糖的單糖類型 、 數(shù)目 、 連接方式及苷建構(gòu)型 。 常用化學(xué)法和儀器分析法 。 ? 多糖組分與分子比例測(cè)定法：部分酸解法 、 完全酶解法 、 色譜法； ? 吡喃 、 呋喃環(huán)形式結(jié)構(gòu)的分析：紅外光譜； ? 連接次序：選擇性光譜法、糖苷鍵順序水解、核磁共振法 ? α－、 β－異頭異構(gòu)體：糖苷酶水解、核磁共振； ? 羥基被取代情況：甲基化反應(yīng)、氣相色譜、過(guò)碘酸氧化、Smith 降解法和測(cè)硫酸基法 (terho 法 )、核磁共振法、質(zhì)譜法 。 ? 糖鏈、肽鏈連接方式：?jiǎn)翁桥c氨基酸組成、稀堿水解法、肼解反應(yīng)； ? 多糖結(jié)構(gòu)的分析方法很多 ， 迄今沒(méi)有一種方法可以單獨(dú)完成多糖結(jié)構(gòu)的分析 。 儀器分析與化學(xué)方法相結(jié)合是常用的多糖結(jié)構(gòu)測(cè)定方法 。 結(jié)構(gòu)測(cè)定 —— 多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定 ? 研究多糖的二級(jí)結(jié)構(gòu)常用的手段是 NMR 技術(shù) ， 如 2D－ NMR， 13CNMR譜 ， 通用的方法是將現(xiàn)代 NMR 技術(shù)與理論計(jì)算相結(jié)合 ， 通過(guò)一定的理論計(jì)算篩選構(gòu)象， 主要的理論計(jì)算方法有從頭計(jì)算 、 豐度經(jīng)驗(yàn)計(jì)算及經(jīng)驗(yàn)力場(chǎng)計(jì)算 。 ? 圓二色譜法 （ CD） 也可用于糖的構(gòu)象分析 。 ? 近年來(lái) ， 以精確三維結(jié)構(gòu)知識(shí)為基礎(chǔ)揭示重要生命活動(dòng)的規(guī)律已達(dá)到前所未有的深度和廣度 ， 多糖作為一類重要的生物活性大分子其結(jié)構(gòu)的研究勢(shì)必推動(dòng)對(duì)多糖的認(rèn)識(shí)向深層次發(fā)展 。 ?謝謝！
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