【正文】 樣緩沖液:100 HiM TrisHCl (),4% SDS, %漠酣藍,20%甘油,200 mmol/L P疏基乙醇，ddH20；5x電泳緩沖液：、94 g甘氨酸、5 g SDS溶解于800 mL蒸館水中，然后 用蒸館水定容至IOOOmL,室溫保存，用時稀釋5倍；考馬斯亮藍R250染色液：取Ig考馬斯亮藍R250置于燒杯中，加入225mL甲醇， 攬掉溶解；加入50mL冰乙酸，攬梓均勾，加入225 HiLddHzO攬梓均勾，過濾后室溫保 存；脫色液：50 ml冰乙酸、225 mL甲醇、225 mLddI^O充分混合后使用。 實驗攤 卿沉淀法：1) 將半夏洗凈去皮干燥至恒重，置研鉢中研磨至粉狀，加入5倍體積的提取緩沖液(PBS) 浸泡24 h；2) 4 T, 12,000 rpm,離心 20min,取上清；3) 加入2倍體積4 C預冷的丙雨，混勾后靜置IOmin,有絮狀沉淀產生。4) 小心棄去上清液,沉淀用PBS溶解,溶解液在4 T下對PBS透析48 h,4 T, 12,000 ipm, 離心20min,取上清液，20T保存。95o/o(NH4》2S04 鹽析法：I)將半夏洗凈去皮千燥至恒重，置研鉢中研磨至粉狀，加入5倍體積的提取緩沖液(PBS)浙江理工大學碩士學位論文浸泡24h。2) 4 176。C, 12,000 rpm,離心 20min,取上清；3) 加入固體(NH4)2S04使飽和度至95%,加(NH4)2S04過程中要勾速摸摔；4) 4T,鹽析過夜，然后4T, 12,000 rpm,離心20min,棄上清；5) 沉淀用PBS溶解,溶解液在4 176。C下對PBS透析直至透析液中檢測不到(NH4)2S04, 4 12,000 rpm,離心 20min,取上清，20176。C 保存。三氣醋酸(^乂》丙麗法：1) 將半夏洗凈去皮干燥至恒重，研磨至粉末狀，加入5倍體積的提取液，20176。C靜置過夜；2) 4176。C, 12,000 rpm,離心 35min,棄上清；3) %的P琉基乙醇的丙雨溶液清洗沉淀，搖勾后，20 T靜 置Ih。4) 4176。C, 12,000 rpm,離心 35min,棄上清；5) 重復3)、4)將沉淀洗潘3次，于4176。C揮干，即得到所需干粉；6) 蛋白千粉加入4倍體積的裂解液，潤旋，靜置30min。直至蛋白千粉充分溶解；7) 4 174。C, 12,000 rpm,離心35 min,取上清即可?？膳R時保存在4 T備用(長期保存于20 T), Tris飽和爵法：1) 將半夏洗凈去皮干燥至恒重，研磨至粉末狀，加入5倍體積的提取緩沖液(PBS),混句， 靜置Ih。2) 4176。C, 12,000 rpm,離心 30 min,取上清；3) 加入等體積的Tris飽和盼，禍旋IOmin,靜置I h。5) 13 174。C, 12,000 rpm,離心 5 min,收集粉相；6) 加入3倍體積的蛋白沉淀液，混勾，20176。C過夜；7) 4176。C, 12,000 ipm,離心 30 min,收集沉淀；8) 加入3倍體積的蛋白沉淀液，混勾，靜置30 min。9) 4176。C, 12,000 rpm,離心 30 min,收集沉淀；10) 重復 8)、9) 一次；11) 預冷丙飼洗3次，每次靜置30min,沉淀于4T揮干，得到蛋白干粉；12) 蛋白千粉加入4倍體積的栽解液，禍旋’靜置30min,直至千粉完全溶解；13) 4。(：，12,000 rpm,離心 35 min,取上清，20 T 保存。^PAGE電泳檢糖SDSPAGE凝膠電泳檢測總蛋白采用5%的濃縮膠和15%的分離膠，具體步驟如下:I)凝膠制備():%凝膠82方 Table Composition of 15% SDSPAGE各組分名稱分離膠(15%, 5 mL)各組分體積濃縮膠(5%, 2 mL)各組分體積HiO mL mL30% Acr mL mLBuffer M TrisHCl (pH ) IJmL M TrisHCl (pH ) mL10% SDS mL mL10% AP mL mLTEMED mL mL將兩塊電泳玻璃板制成垂直板槽(注意密封)，垂直固定在灌膠支架上。將按比例配好 的5HiL分離膠溶液倒入槽中，加入2mL蒸饋水，放置約30min,水層和膠層接觸面出現 清晰而直的界面，將蒸館水倒出，用吸水紙吸千剩余的水，倒入按比例配好的2 HiL濃縮 膠，小心插入樣梳。靜置至濃縮膠凝聚，約30min。2) 樣品制備：將樣品制備成合適的濃度，分別取樣品10 HiL離心管中，再分 別加入IOhL 2X上樣緩沖液，混勾后IOOT金屬浴加熱3 min,取出稍離心，待用。標準 蛋白質取10 mL離心管中，95 T金屬浴加熱5 min,取出待用。3) 上樣：將膠板固定于垂直電泳槽中，倒入電泳緩沖液，沒過樣梳。小心拔出樣梳，用微 量移液器分別吸取20 ^iL樣品注入樣品槽中，標準蛋白上樣10 jiL。4) 電泳：上樣后接通電源，上槽接電源負極，下槽接正極，開始電流控制在1520 mA, 當染料進入分離膠后，調為30 mA,電壓在80120 V,漠盼藍距凝膠邊緣約5 mm時，停 止電泳。5) 染色：電泳完畢后，取出凝膠板,將膠剝離凝膠板，在水中浸泡約5min,浸出部分SDS, 然后放在大培養(yǎng)皿內，加入染色液。染色至少2 h。6) 脫色：染色后的凝膠板用蒸館水漂洗數次，洗掉凝膠表面的染料，再用脫色液脫色，直 到蛋白質區(qū)帶清晰。 19浙江理工大學碩士學位論文總蛋白含量測定方法參考Bradford蛋白濃度測定試劑盒，具體步驟如下：1) 取8支(或者更多)干凈的試管，編號；2) 取 100 HL BSA,加 PBS mL 稀釋至終濃度為 mg/mL；3) 5xG250染色液使用前顛倒35次混勾，取10 mL 5G250染色液，加入40mL雙蒸水, 混勾成1XG250染色液，此1XG250染色液可在4 T保存一周；4) (以每孔5 ml計，多余的用來清洗比色皿表2,2 Bradford蛋白濃度測定操作表 Table Procedure for determination of protein of Bradford method離心管編號標準蛋白BSA體積(nL,已稀釋）PBS 體積(JiL)1XG250染色液體積(mL)IO5005210040053200300543002005540010056500O57(樣品I)500 JiL造當稀釋的樣品IO58(樣品2)500 HL適當稀釋的樣品2O59(樣品3)O55) 反應3min后，在595 nm處測吸光值A,并記錄。 不同方法提取半夏總蛋白的SDSPAGE電泳結果采用四種不同方法提取半夏總蛋白，經15% SDSPAGE電泳檢測， 每次實驗設三個重復，重復實驗3次。四種方法提取半夏總蛋白15% SDSPAGE電泳行 為：蛋白條帶都主要出現在12kDa和24kDa處,在35kDa處也有條帶出現，蛋白電泳行 為沒有很大差別。但蛋白條帶所表示出的蛋白濃度95% (NH4)2S04鹽析法和TCA，丙飼法提 取半夏總蛋白明顯要高于丙飼沉淀法和Tris飽和粉法提取的半夏總蛋白。四種方法提取的總蛋白中12kDa和24kDa的蛋白含量均很高，是塊蓮中的主要蛋白，半夏是真核生物， 但其總蛋白條帶少，原因可能是在干燥處理過程中含量低、分子量大的蛋白發(fā)生降解，對 熱不穩(wěn)定，在變性膠電泳處理過程中蛋白質也因發(fā)生變性而降解，而12 kDa、24 kDa和 35kDa對熱穩(wěn)定，變性處理時也相對穩(wěn)定。結果表明95% (NH4)2S04鹽析法和TCA丙雨法提取半夏總蛋白15% SDSPAGE電泳 效果優(yōu)于丙飼沉淀法和Tris飽和盼法提取的半夏總蛋白。^pf M I 2 39。 J I39。I5i^171。r 二r‘. mm 39。 I I 衫力,i 39。時35^參’■雄 I 55jO參 M ArnOmm 。|M力一 ——M I 2 3 4mm T 4 B$m MtdIlitmMMA% SDSPAGE電泳圉M:標準蛋白質( kDa) I:丙雨沉淀法2: 95o/o(NH()2S04鹽析法 3： TCA丙觸法4: Tris飽和粉法 Fig. Results of 15% SDSPAGE electrophoresis of total protein in Pinellia ternata M: Unstained protein molecular weigh maker ( kDa)。 I: acetone precipitation。 2:95% saturated ammonium sulfate precipitation。 3: TCAacetone precipition。4： Tris*equilibrium phenol precipitation 總蛋白的含量測定三次重復四種不同方法提取半夏總蛋白’取相同質量的材料，提取的蛋白質溶液定容 至同一體積，均取10^11^上樣，經15% SDSPAGE電泳檢測，結果顯示，95%(NH4)2S04 鹽析法和TCA丙飼法提取效果相對較好，丙雨法提取的總蛋白條帶最淡，Tris飽和酣法 提取的總蛋白條帶相對濃于丙雨法提取的總蛋白。為了進一步確定最佳的半夏總蛋白提取方法，采用Bradford蛋白含量測定試劑盒對三 次重復實驗這四種方法提取的半夏總蛋白樣品進行含量測定，. 3所示。浙江理工大學碩士學位論文s* 7 6 5 4 3 2 IANV Av AM O A—^ AM^ay=+ R*39。=2510012020 40 $0 80IfiMl (Hg) + R==s6s(IO?蛋白質含l：Qig)蛋白Mt W a:重復實驗I的標準曲線；b:重復實驗2的標準曲線；C:重復實驗3的標準曲線 Fig. The standard curve of the three repeat experiments The standard curve of experiment I。 b: The standard curve of experiment 2。 c: The standardcurve of experiment 3表2*3標準蛋白BSA A595值 Table A595 value of standard protein BSA編號A595(n=l)A595(n=2)A595(n=3)IOOO23456三次重復實驗提取半夏總蛋白質含量的測定，根據試劑盒的測定范圍和推測的不同方 法提取的總蛋白的濃度大小，確定符合試劑盒測定范圍的樣品量，分別取丙飼沉淀法提取 的總蛋白IOO^iL, 95%(NH4)2S04鹽析法提取的總蛋白IOOhL, TCA丙銅法提取的總蛋白 50 uL, Tris飽和粉法提取的總蛋白100 JiL用于總蛋白含量測定，分別用PBS稀釋至500 。 Table A595 value of total protein in Pinellia ternata of the three repeat experiments編號A595(n=l)A595(n=2)A595(n=3)I234《定結果 Table Results ofdetermation of total protein content in PinelUa ternata extracted by four differentmethods編號濃度(mg/mL) (n=濃度(mg/mL) (n=2)濃度(mg/mL) (n=3)I234注：I:丙飼沉淀法2: 95%(NH4)2S04鹽析法3: TCA丙觸法4: Tris飽和紛法由標準曲線可以計算三次重復四種方法提取的半夏總蛋白濃度。 ,重復一實驗中四種方法提取的半夏總蛋白含量為TCA丙銅法( mg/mL) 950/0 (NHj)2SO4 娃析法( mg/mL)Tris飽和盼法( mg/mL)丙雨法( mg/mL),重復實驗二和三的結果趨勢和重復實驗一符合，四種方法提取總蛋白含量的關系 為TCA丙飼法95。/。(NH4)2SO4鹽析法Tris飽和盼法丙雨法,與i5187。/o SDSPAGE電泳 檢測結果一致，從蛋白電泳行為和蛋白濃度兩方面推定TCA丙爾法是最佳的半夏總蛋白 提取方法，故半夏總蛋白的提取采用TCA丙雨法。 討論與小結半夏蛋白是半夏重要的有效成分之一’具有重要的藥理作用，半夏總蛋白的含量高低 直接反應半夏質量的好壞。半夏總蛋白的提取沒有確定的方法，目前最常用的方法是 (NH4)2S04分段鹽析法，此法只能提取某一飽和度(NH4)2S04下半夏的總蛋白，孫光星等【6n 用生理鹽水為提取液用丙飼沉淀的方法提取掌葉半夏總蛋白，但本實驗發(fā)現，該法不能充 分提取半夏總蛋白。植物總蛋白的提取方法有多種，需要根據不同的實驗材料選取不同的實驗方法。本實 驗對植物總蛋白提取最常用和經典的四種方法提取的半夏總蛋白質量進行比較分析，尋找 半夏總蛋白提取較優(yōu)的方法。四種方法各有優(yōu)劣，最方便省時的是丙