血紅蛋白的提取與分離-資料下載頁(yè)
2025-01-06 09:09本頁(yè)面
【正文】 有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，并且容易被皮膚吸收，因此操作必須在通風(fēng)櫥內(nèi)或通風(fēng)處進(jìn)行。 TEMED和過(guò)硫酸胺對(duì)黏膜和上呼吸道組織、眼睛、皮膚等有很大的破壞作用，吞服可致命。因此在進(jìn)行電泳操作時(shí)一定按照實(shí)驗(yàn)要求和步驟完成。操作時(shí)要戴好一次性手套。 ① SDS聚丙烯酰胺 分離膠制備 1)根據(jù)廠家說(shuō)明書(shū)安裝電泳用的玻璃板 2） SDS— 聚丙烯酰胺凝膠 制備 用去離子水 mL， 30%的丙烯酰胺 mL，、 pH Tris緩沖液 mL， 10%的SDS mL， 10%的過(guò)硫酸胺 mL， TEMED ，混合均勻，迅速灌注在兩玻璃板的間隙中間，要留出灌注濃縮膠所需空間 (梳子的齒長(zhǎng)再加 cm)，再在膠液面上小心注入一層水（約高 2— 3 mm），以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液。 （ 2）電泳方法步驟 ③ 配制 SDS— 聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠溶液。用去離子水 mL， 30%的丙烯酰胺 mL， mol、 pH Tris緩沖液 mL， 10%的 mL， 10%的過(guò)硫酸胺 mL， TEMED mL，混合均勻，直接灌注在聚合的分離膠上，并立即在濃縮膠溶液中插入干凈的梳子。整個(gè)操作過(guò)程應(yīng)注意避免氣泡的產(chǎn)生。然后再補(bǔ)加濃縮膠溶液，使其充滿梳子之間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫下聚合。 ② 分離膠聚合完全后（約 30 min），傾出覆蓋水層，再用濾紙吸凈殘留水。 3）樣品處理 5)加樣 在電泳樣品中按 1∶1 體積比加入樣品處理液，在 100 ℃ 溫度下加熱 3 min，以使蛋白質(zhì)變性。 按順序加樣，加樣量通常為 10— 25 μL 。樣品可以多加幾個(gè)，例如，血漿樣品紅細(xì)胞破碎后(即進(jìn)行凝膠色譜分離之前 )的樣品和凝膠色譜分離之后的樣品 4）濃縮膠聚合完全后（ 30 min），小心移出梳子。把凝膠固定于電泳裝置上，上下槽各加入Tris— 甘氨酸電泳緩沖液。必須設(shè)法排出凝膠底部?jī)刹ＡО逯g的氣泡。 7）剝膠 從電泳裝置上卸下玻璃板，用刮刀撬開(kāi)玻璃板。將緊靠最左邊一孔（第一槽）凝膠下部切去一角，以標(biāo)注凝膠的方位。 8）染色 將電泳凝膠片放在考馬斯亮藍(lán)染色液中染色 12 h。 6)電泳 將電泳裝置與電源相接，凝膠上所加電壓為 8 V/cm。當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后，把電壓提高到 15 V/cm，繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部上方約 1 cm處，關(guān)閉電源。 10)觀察結(jié)果： SDS電泳的成功關(guān)鍵之一是電泳過(guò)程中，待別是樣品制備過(guò)程中蛋白質(zhì)與 SDS的結(jié)合程度。 9)脫色： 染色完畢，傾出染色液 ,換脫色液脫色310 h，其間需多次更換脫色液至背景清楚。 觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見(jiàn)教科書(shū)圖 518），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。 三 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià) 由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚糖 — 2022或紅色葡聚糖，觀察色帶移動(dòng)的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說(shuō)明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時(shí)要重新裝柱。 如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說(shuō)明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。 討論：如何測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量？ 使用 SDS— 聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量時(shí)， 可選用一組已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時(shí)進(jìn)行電泳 ，根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳區(qū)帶位置，用 電泳遷移率和分子量的對(duì)數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線， 可以測(cè)定未知蛋白質(zhì)的分子量。市場(chǎng)上有高分子量、次高分子量及低分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑出售
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