【正文】 （二）凝膠色譜操作 問： 正確的加樣操作，注意什么？ 不要觸及破壞凝膠面 貼壁加樣 使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動 答：讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的 pH范圍內，維持結構和功能。 討論： 在血紅蛋白的整個過程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么？ 實驗操作 （二）凝膠色譜操作 討論： 與其他真核細胞相比，紅細胞有什么特點？這一特點對你進行蛋白質得分離有什么意義？ 答：血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。 血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。 首先通過洗滌紅細胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理；再經過透析去除分子量較小的雜質，即樣品的粗分離； 然后通過凝膠色譜法將相對分子質量較大雜質蛋白除去，即樣品的純化； 最后經聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定。 討論： 你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎？ 實驗操作 （二）凝膠色譜操作 你能從凝膠色譜的分離原理分析為什么凝膠的裝填要緊密、均勻嗎？ P70 答：凝膠實際上是一些微小的多孔球體，小球體內部有許多貫穿的通道。相對分子質量較大的蛋白質分子不能進入凝膠顆粒內部，只能分布在顆粒之間，通過的路程較短，移動速度較快；相對分子質量較小的蛋白質分子比較容易進入凝膠內的通道，通過的路程較長，移動速度較慢。因此，樣品中相對分子質量較大的蛋白質先流出，相對分子質量中等的分子后流出，相對分子質量最小的分子最后流出，從而使各種相對分子質量不同的分子得以分離。如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會在色譜柱內形成無效的空隙，使本該進入凝膠內部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液的流動次序，影響分離的效果。 觀察你處理的血液樣品離心后 是否分層 （見教科書圖 518）， 如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。 此外，離心速度過高和時間過長，會使白細胞和淋巴細胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。 結果分析與評價 你是否完成了對血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？ 由于凝膠是一種半透明的介質，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。 此外，還可以 加入大分子的有色物質， 例如藍色葡聚糖 — 2022或紅色葡聚糖， 觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。 如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。 你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？ 結果分析與評價 如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關。 你能觀察到蛋白質的分離過程中，紅色區(qū)帶的移動嗎？請描述紅色區(qū)帶的移動情況，并據此判斷分離效果？ 結果分析與評價 練習 1．答：凝膠色譜法也稱為分配色譜法，它是根據分子量的大小分離蛋白質的方法之一。所用的凝膠實際上是一些微小的多孔球體，這些小球體大多數(shù)是由多糖類化合物構成，小球體內部有許多貫穿的通道，當一個含有各種分子的樣品溶液緩慢流經時，各分子在色譜柱內進行兩種不同的運動，即垂直向下的運動和無規(guī)則的擴散運動。相對分子質量較大的蛋白質分子不能進入凝膠顆粒內部，只能分布在顆粒之間，通過的路程較短，移動速度較快；相對分子質量較小的蛋白質分子比較容易進入凝膠內的通道，通過的路程較長，移動速度較慢。因此，樣品中相對分子質量較大的蛋白質先流出，相對分子質量中等的分子后流出，相對分子質量最小的分子最后流出，這種現(xiàn)象又叫分子篩現(xiàn)象。此外，凝膠本身具有三維網狀結構，相對分子質量大的分子通過這種網狀結構上的空隙時阻力大，而相對分子質量小的分子通過時阻力小，因此不同分子量的蛋白質分子可以獲得分離。 凝膠色譜法分離蛋白質的原 理是怎樣的 ? 答：在一定范圍內，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶液 pH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。緩沖溶液通常是由一或兩種化合物（緩沖劑）溶解于水中制得，調節(jié)緩沖劑的配比就可制得不同 pH范圍的緩沖液。 緩沖溶液的作用是維持反應體系的 pH不變。在生物體內進行的各種生物化學過程都是在精確的 pH下進行的，受到氫離子濃度的嚴格調控。為了在實驗室條件下準確地模擬生物體內的天然環(huán)境，就必須保持體外生物化學反應過程有與體內過程完全相同的 pH。 什么是緩沖液？它的作用是什么 ? 練習 4．答：血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理；再經過透析去除分子量較小的雜質，即樣品的粗分離；然后通過凝膠色譜法將相對分子質量大的雜質蛋白除去，即樣品的純化；最后經聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定。 4．你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎 ? 5．與其他真核細胞相比，紅細胞有什么特電 ?這特點對你進行蛋白質的分離有什么意義 ? 5．答：血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。 練習