【正文】 （二）凝膠色譜操作 問： 正確的加樣操作，注意什么？ 不要觸及破壞凝膠面 貼壁加樣 使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng) 答：讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的 pH范圍內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和功能。 討論： 在血紅蛋白的整個(gè)過程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么？ 實(shí)驗(yàn)操作 （二）凝膠色譜操作 討論： 與其他真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞有什么特點(diǎn)？這一特點(diǎn)對你進(jìn)行蛋白質(zhì)得分離有什么意義？ 答：血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過觀察顏色來判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實(shí)驗(yàn)操作。 血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。 首先通過洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理；再經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離； 然后通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量較大雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化； 最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。 討論： 你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎？ 實(shí)驗(yàn)操作 （二）凝膠色譜操作 你能從凝膠色譜的分離原理分析為什么凝膠的裝填要緊密、均勻嗎？ P70 答：凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體，小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道。相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間，通過的路程較短，移動(dòng)速度較快；相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道，通過的路程較長，移動(dòng)速度較慢。因此，樣品中相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出，相對分子質(zhì)量中等的分子后流出，相對分子質(zhì)量最小的分子最后流出，從而使各種相對分子質(zhì)量不同的分子得以分離。如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會(huì)在色譜柱內(nèi)形成無效的空隙，使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液的流動(dòng)次序，影響分離的效果。 觀察你處理的血液樣品離心后 是否分層 （見教科書圖 518）， 如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。 此外，離心速度過高和時(shí)間過長，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。 結(jié)果分析與評價(jià) 你是否完成了對血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？ 由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。 此外，還可以 加入大分子的有色物質(zhì)， 例如藍(lán)色葡聚糖 — 2022或紅色葡聚糖， 觀察色帶移動(dòng)的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。 如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時(shí)要重新裝柱。 你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？ 結(jié)果分析與評價(jià) 如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。 你能觀察到蛋白質(zhì)的分離過程中，紅色區(qū)帶的移動(dòng)嗎？請描述紅色區(qū)帶的移動(dòng)情況，并據(jù)此判斷分離效果？ 結(jié)果分析與評價(jià) 練習(xí) 1．答：凝膠色譜法也稱為分配色譜法，它是根據(jù)分子量的大小分離蛋白質(zhì)的方法之一。所用的凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體，這些小球體大多數(shù)是由多糖類化合物構(gòu)成，小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道，當(dāng)一個(gè)含有各種分子的樣品溶液緩慢流經(jīng)時(shí)，各分子在色譜柱內(nèi)進(jìn)行兩種不同的運(yùn)動(dòng)，即垂直向下的運(yùn)動(dòng)和無規(guī)則的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)。相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間，通過的路程較短，移動(dòng)速度較快；相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道，通過的路程較長，移動(dòng)速度較慢。因此，樣品中相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出，相對分子質(zhì)量中等的分子后流出，相對分子質(zhì)量最小的分子最后流出，這種現(xiàn)象又叫分子篩現(xiàn)象。此外，凝膠本身具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，相對分子質(zhì)量大的分子通過這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上的空隙時(shí)阻力大，而相對分子質(zhì)量小的分子通過時(shí)阻力小，因此不同分子量的蛋白質(zhì)分子可以獲得分離。 凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原 理是怎樣的 ? 答：在一定范圍內(nèi)，能對抗外來少量強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或稍加稀釋不引起溶液 pH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。緩沖溶液通常是由一或兩種化合物（緩沖劑）溶解于水中制得，調(diào)節(jié)緩沖劑的配比就可制得不同 pH范圍的緩沖液。 緩沖溶液的作用是維持反應(yīng)體系的 pH不變。在生物體內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué)過程都是在精確的 pH下進(jìn)行的，受到氫離子濃度的嚴(yán)格調(diào)控。為了在實(shí)驗(yàn)室條件下準(zhǔn)確地模擬生物體內(nèi)的天然環(huán)境，就必須保持體外生物化學(xué)反應(yīng)過程有與體內(nèi)過程完全相同的 pH。 什么是緩沖液？它的作用是什么 ? 練習(xí) 4．答：血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理；再經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；然后通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。 4．你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎 ? 5．與其他真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞有什么特電 ?這特點(diǎn)對你進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離有什么意義 ? 5．答：血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過觀察顏色來判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實(shí)驗(yàn)操作。 練習(xí)