多糖分離純化及含量測定(參考版)
2025-05-19 01:59本頁面
【正文】 ? 近年來 ， 以精確三維結(jié)構(gòu)知識為基礎(chǔ)揭示重要生命活動的規(guī)律已達到前所未有的深度和廣度 ， 多糖作為一類重要的生物活性大分子其結(jié)構(gòu)的研究勢必推動對多糖的認識向深層次發(fā)展 。 結(jié)構(gòu)測定 —— 多糖高級結(jié)構(gòu)測定 ? 研究多糖的二級結(jié)構(gòu)常用的手段是 NMR 技術(shù) ， 如 2D－ NMR， 13CNMR譜 ， 通用的方法是將現(xiàn)代 NMR 技術(shù)與理論計算相結(jié)合 ， 通過一定的理論計算篩選構(gòu)象， 主要的理論計算方法有從頭計算 、 豐度經(jīng)驗計算及經(jīng)驗力場計算 。 ? 糖鏈、肽鏈連接方式：單糖與氨基酸組成、稀堿水解法、肼解反應； ? 多糖結(jié)構(gòu)的分析方法很多 ， 迄今沒有一種方法可以單獨完成多糖結(jié)構(gòu)的分析 。 常用化學法和儀器分析法 。 ? 常用方法：滲透壓法 、 蒸氣壓滲透劑法 、 端基法 、 粘度法 、 光散射法 、 凝膠色譜法 、 超過率法 、 沉淀法 、凝膠電泳法 、 HPLC 法 、 超離心分析法 、 分子篩色譜法 、 GPC（ 凝膠滲透色譜 ） 法 、 MALDI－ TOF－ MS （ 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜 ） 法 。 ? 現(xiàn)在應用較多的是 HPLC 法 ， 旋光度測定也是純度測定的一種方法 。 四、純度與相對分子質(zhì)量的檢測 ? 純度鑒定 ? 分子量的測定 ? 結(jié)構(gòu)測定 包括多糖一級結(jié)構(gòu)測定 、 多糖高級結(jié)構(gòu)測定 純度鑒定 ? 多糖是高分子化合物 ， 其純品微觀上是不均一的 ， 通常所說的多糖純品實質(zhì)上是一定分子量范圍的均一組分 。 ? 該法的原理在于糖醛酸在硫酸存在下會與 咔唑 反應生成含羰基的紫紅色產(chǎn)物。 ? 再將通過硫酸 苯酚法或者蒽酮 硫酸法得到的總糖結(jié)果減去還原糖 , 即得較準確的多糖含量 。 ? 為排除還原性單糖的干擾 , 可采用 DNS( 3, 5二硝基水楊酸 )比色法測定還原糖含量 。 ? 其次 , 顯色試劑的不專屬 , 單糖的干擾嚴重 , 實際上測得的結(jié)果是總糖的結(jié)果 。 蒽酮 硫酸法的原理 ? 蒽酮 硫酸法其原理是糖類與濃硫酸在沸水浴中迅速 脫水生成糠醛或其衍生物 , 再與蒽酮試劑縮合 , 形成藍綠色溶液 , 在 620 nm 處有最大吸收 , 吸收值與糖的含量呈線性關(guān)系 。 糠醛酸在此條件下往往脫羧 , 并生成糠醛 。 苯酚 硫酸法的原理 ? 多糖在硫酸存在下先水解成單糖 , 再脫水生成具有呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物 。 三、多糖含量的測定方法 ? 多糖含量測定常規(guī)方法是以 無水葡萄糖為對照品 , 采用苯酚 硫酸法 , 或者蒽酮 硫酸法 。 根據(jù)這一性質(zhì)可在多糖的濃縮水溶液中分批加入乙醇 ， 使乙醇的體積濃度逐漸增加到 50， 100， 200， 900 mL/L， 從而使不同聚合度的多糖分別沉淀析出 。 ? 把欲分離的可親和的一對分子的一方作為 配基 (ligand)與不溶性載體結(jié)合使固定化 , 裝入色譜柱 (親和柱 ), 然后把含有欲分離的多糖溶液作 流動相 , 這時溶液中只有能和 配基具有親和力的多糖分子被結(jié)合而吸附 , 其他多糖則流出柱外 , 然后再改變流動相的離子強度及 pH, 使配基與多糖解離 , 則被純化的多糖就流出柱外 。 親和層析 ? 某些特定多糖具有和某些相對應的專一分子可逆結(jié)合的特性 , 如一種 凝集素 (刀豆球蛋白 ) 能專一地與分支多糖結(jié)合 。 ? 常用的凝膠有各種型號的交聯(lián)葡聚糖凝膠 (Sephadex)、 瓊脂糖凝膠 (Sepharose) 和聚丙烯酰胺凝膠 (Biogel)三大類 ， 以及后來在這些凝膠上進行性能改良的新一代凝膠 , 如 Sephacryl、 Superdex 和 Superose 等 。 通常在獲得粗多糖后 , 先用陰離子交換柱層析 、 透析 、 干燥 , 溶解后再用凝膠柱層析 。 凝膠柱層析 ? 它是 根據(jù)多糖分子的大小和形狀的不同即按分子篩的原理進行分離的 。 ? 陰離子交換柱層析適合于分離各種酸性 、 中性多糖及粘多糖 。 通過柱層析, 多糖溶液得到濃縮及初步純化 (有的多糖通過該步驟即可得到各種均一多糖組分 )。 它有較大的比表面積 , 雖然其離子交換容量僅為 ~ mmol/g, 但其對多糖的吸附量較離子交換樹脂大許多 。 陰離子交換柱層析 ? 至今應用最廣泛的陰離子交換劑有二乙基氨基乙基纖維素 (DEAEcellulose) , DEAE葡聚糖 (DEAESephadex) 及DEAE瓊脂糖 (DEAESepharose) 三種 , 其中以 DEAEcellulose 應用得最廣泛 。 其理論塔板數(shù)較高 ,
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