核酸的分離純化ppt課件(參考版)
2025-05-04 01:09本頁面
【正文】 Streptavidin 磁 四、 mRNA的分離純化 。 3180。 Streptavidin 磁 洗滌與洗脫 水相 (含純化的 mRNA) 固相 生物素標(biāo)記的 oligo(dT) 磁鐵 5180。 磁鐵 3180。 Streptavidin 磁 生物素與鏈親和素的特異性結(jié)合 磁性分離 5180。 3180。 鏈親和素標(biāo)記的磁珠 + Streptavidin 磁 5180。 3180。 + 總 RNA中的 poly(A) +RNA分子 退火形成雜交體 5180。 3180。末端帶有長短不同的 poly（ A） 尾巴 ? 利用堿基配對原則 ， 通過 oligo（ dT） 纖維素或 poly（ U） 瓊脂糖凝膠的親和層析 ， 可以很容易地從總 RNA制品中分離純化 mRNA （ dT） 纖維素柱層析法 （ dT） 纖維素柱離心法 （ dT） 纖維素液相結(jié)合離心法 四、 mRNA的分離純化 5180。 三、商品化試劑單相裂解法 ? 是異硫氰酸胍 酚 氯仿一步法的改進方案 ? 以 異硫氰酸胍 酚 的單相裂解液裂解細胞 ， 再加入 氯仿 后形成兩相 三、商品化試劑單相裂解法 ? 變性的 DNA與蛋白質(zhì)介于兩相的交界面 ， 可使用乙醇和異丙醇分級沉淀出來 ? 保留于上層水相的 RNA， 通過異丙醇沉淀與 75%乙醇洗滌而制備 三、商品化試劑單相裂解法 目前 ， 該法已成為實驗室最常用的總 RNA提取法 ， 其產(chǎn)量及質(zhì)量與酸性異硫氰酸胍 酚 氯仿一步法相當(dāng) 。g總 RNA， 每 106個細胞大約能制備 4～ 10181。 ? 蛋白質(zhì)由于密度小而浮于液面 ? RNA密度大而沉于管底 ? 各種 DNA密度介于蛋白質(zhì)與 RNA之間，處于中部 五、質(zhì)粒 DNA的純化 EBCsCl密度梯度離心法 五、質(zhì)粒 DNA的純化 不同分子構(gòu)型的 DNA與 EB的結(jié)合能力不同，密 度下降也不同，因而可將它們有效分離開。 但由于部分質(zhì)粒DNA會與細胞碎片纏繞在一起而丟失 ， 故產(chǎn)率不高 。 一、堿裂解法 ? 細胞裂解后 ， 細胞壁 、 細胞膜的碎片 、 變性的蛋白質(zhì)和 染色體 DNA形成大的復(fù)合物 ? 當(dāng) pH調(diào)至中性 ， 質(zhì)粒 DNA重新恢復(fù)天然的超螺旋結(jié)構(gòu) ? 在高鹽條件下沉淀 ， 經(jīng)離心分離 ， 質(zhì)粒 DNA保留在上清液中 一、堿裂解法 二、煮沸裂解法 將細菌懸浮于含 TritonX100和溶菌酶 的緩沖液中 ， TritonX100和溶菌酶能破壞細胞壁 ， 再用沸水浴裂解細胞 ， 并使宿主細胞的蛋白質(zhì)與 DNA變性 。 費時但操作簡單 ，是小片段 DNA回收的較好方法 。 三、玻棒纏繞法 玻棒 纏繞法是在 Bowtell(1987)方法的基礎(chǔ)上經(jīng)改進而來 四、其它方法 有些分子診斷技術(shù)并不需要高分子量的DNA樣品 ， 因此步驟簡化 、 操作簡便的 DNA快
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