核酸電泳ppt課件(參考版)
2025-05-04 01:09本頁(yè)面
【正文】 Contourclamped homogeneous electric field (CHEF) (Chu, et al., 1986, 1990) Increased separation of the 2050 kb range with field inversion gel electrophoresis (FIGE) 鉗位均勻電場(chǎng)凝膠電泳 倒轉(zhuǎn)電場(chǎng)凝膠電泳 。與分子量較小的 DNA分子相比、分子量較大的 DNA分子需要更多次地更換其構(gòu)型和方位，以使其可以按新的方向游動(dòng)。 在標(biāo)準(zhǔn)的脈沖電場(chǎng)凝膠電泳中、頭一個(gè)脈沖的電場(chǎng)方向與核酸移動(dòng)方向成 45度夾角，而下一個(gè)脈沖的電場(chǎng)方向與核酸移動(dòng)方向在另一側(cè)亦成 45度夾角。 1984年 , (PFGE)技。哺乳動(dòng)物主要組織相容性基因座 (locus)所占的 DNA長(zhǎng)度亦達(dá)數(shù)千 kb。通過(guò)不斷交替改變電場(chǎng)方向，選擇恰當(dāng)?shù)拿}沖時(shí)間等條件，可將 35－ 10000kb的 DNA分子在凝膠中予以分辨。 大于 30kb和 DNA分子在電泳中只能頭尾牽引進(jìn)入膠孔，需定期改變電場(chǎng)方向使大分子通過(guò)凝膠孔。 ③ 使樣品呈色，使加樣操作更方便 . : 銀染色液中的銀離子 (Ag+)可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用還原劑如甲醛使 Ag+還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染色黑褐色。 EB的突出缺點(diǎn)： 為中度毒性的強(qiáng)誘變劑 (302nm透照， 254nm外照 ) 電泳載樣緩沖液 (Loading buffer): 核酸電泳常用的指示劑有 溴酚蘭 和 二甲苯青 及銀染色 . 溴酚蘭 在堿性液體中呈紫蘭色，在 %、 1%、 %和 2%瓊脂糖凝膠電泳中，溴酚蘭的遷移率分別與 1Kb、 、 DNA片段大致相同 . 二甲苯青 的水溶液呈蘭色，它在 1%和 %瓊脂糖中電泳時(shí)，其遷移速率分別與 2Kb和 DNA大致相似 . 指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖 400組成 載樣緩沖液 . 載樣緩沖液的作用有 : ① 增加樣 品密度，使其比重增加，以確保 DNA均勻沉入加樣孔內(nèi) 。 溴化乙錠是一種具扁平分子的核酸染料．可以插入列 DNA或 RNA分子的堿基之間。 角，可減少液體泄漏的機(jī)會(huì) . ，將玻璃板插入電泳槽中，上緊，倒入 緩沖液 . ，立即用緩沖液沖洗加樣孔，因?yàn)槭嶙尤〕龊?，? 子上吸附的及凝膠頂部未聚合 的丙烯酰胺會(huì)流入加樣孔內(nèi)聚合，產(chǎn) 生不規(guī)則的表面，將導(dǎo)致以后 DNA電泳帶型不規(guī)則 . DNA樣品與適量的載樣緩沖液混勻后，加到樣品孔內(nèi)，加樣時(shí)不 要產(chǎn)生氣泡 . ，電壓為 18V/cm，進(jìn)行電泳 . . ，切斷電源，棄去電泳儀，取出膠床板，小心移去一塊玻 璃板，讓凝膠吸附在另一塊玻 璃板上 .浸入含 ， 15～ 30min后取出水洗紫外儀下觀察結(jié)果 . 10ng以上量的 DNA條帶 .要求更高 的靈敏度，可用銀染 . 同濃度丙烯酰胺和 DNA的 有效分離范圍（表 3） 丙烯酰胺 (%) 有效分離范圍(bp) 溴酚蘭 * 二甲苯青 * 100～ 2022 100 460 80～ 500 65 260 60～ 400 45 160 40～ 200 30 70 25～ 150 15 60 10～ 100 12 45 *表中給出的數(shù)字為與指示劑遷移率相等的雙鏈 DNA分子所含堿基對(duì)數(shù)目 (bp). DNA染色 : a. 溴化乙錠 (Ethidium bromide， EB) 在凝放電泳中，加入溴化乙錠染料對(duì)核酸分子染色之后 (凝膠電泳液中加入終濃度為 ) 。比瓊脂糖凝膠的紫外線吸收低、抗腐蝕性 強(qiáng)、機(jī)械強(qiáng)度高、韌性好。 聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體，在催化劑 TEMED(N， N， N， N‘一四甲基乙二胺 )和 過(guò)硫酸銨 的作用下， 丙烯酰胺 聚合形成長(zhǎng)鏈，聚丙烯酰胺鏈在交聯(lián)劑， N， N‘亞甲雙丙烯酰胺 (甲叉雙丙烯酰胺 )參與下，聚丙烯胺鏈與鏈之間交叉聯(lián)接而形成凝膠 . 注意： 丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺 都具有神經(jīng)毒性 ，能夠經(jīng)過(guò)皮膚及呼吸道進(jìn)入體內(nèi)，會(huì)因多次積蓄而中毒；故操作時(shí)要極其小心，需戴手套各面罩。 但對(duì)于小片斷的 DNA可以 520 V/cm電壓電泳 凝膠制備的注意事項(xiàng) ? 配膠和電泳需要使用同一批次的緩沖液（一些限制酶緩沖液含有高濃度鹽，能減慢 DNA的遷移，并可使臨近孔泳帶變斜） ? 瓊脂糖要徹底熔化，時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng) ? EB含量要適當(dāng) ? 凝膠應(yīng)存放在陰涼處，再次用時(shí)加入少量電泳液，再熔化 ? 檢查梳子 ? 拔取梳子時(shí)應(yīng)均勻用力，檢查凝膠孔的整齊度 ? 凝膠稍厚些，避免樣品溢出 電泳時(shí)間 ? PCR產(chǎn)物，應(yīng)該在 24h之內(nèi)電泳 ? 電泳時(shí)間不易過(guò)長(zhǎng)，對(duì)于長(zhǎng)片斷影響不大，但對(duì)小片斷 DNA影響明顯 ? 電泳期間， EB向陰極遷移，與 DNA遷移方向相反，長(zhǎng)時(shí)間電泳將導(dǎo)致凝膠中 EB含量顯著較少，小片斷 DNA檢測(cè)發(fā)生困難 電泳上樣量 ? 中號(hào)梳子： 8— 10ul ? 小號(hào)梳子： 6— 8ul ? 上樣注意事項(xiàng)： 加樣時(shí)應(yīng)懸空 加樣盡可能快 不必每一個(gè)樣品用一個(gè)吸頭 上樣量中 DNA含量過(guò)高
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