【正文】 。其檢測(cè)的原理類似于抗原、抗體檢測(cè)的 ELISA法。 3 酵母雙雜交系統(tǒng) 雙雜交系統(tǒng)的原理 LacZ Gal4激活域 Gal4結(jié)合域 Gal4結(jié)合域 LacZ LacZ Gal4激活域 LacZ Gal4激活域 Gal4結(jié)合域 X Y X Y 1） 已知蛋白之間相互作用的檢測(cè)： 2） 蛋白質(zhì)的功能域研究：通過(guò)對(duì)其中某一個(gè)蛋白質(zhì)作缺失或定點(diǎn)突變 ， 再用此系統(tǒng)檢測(cè)是否還存在相互作用 ， 可闡明其功能域或關(guān)鍵氨基酸； 3） 克隆新基因和新蛋白：將感興趣的蛋白質(zhì)基因與 BD基因構(gòu)建成 “ 誘餌 ” 表達(dá)質(zhì)粒 ， 將某一器官或組織的 cDNA文庫(kù)與 AD基因構(gòu)建成 “ 獵物 ” 基因庫(kù) ， 共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞 ，可篩到與感興趣蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)的 cDNA序列 ，并推測(cè)其蛋白質(zhì)序列 。 ? 2） 使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用 ? 3）使用對(duì)照抗體： 單克隆抗體：正常小鼠的 IgG或另一類單抗 兔多克隆抗體：正常兔 IgG ? ? （ 1） 原理： ? 將編碼某一蛋白 X的 DNA序列與 DNA結(jié)合域 BD的編碼序列融合形成一個(gè)雜交體 ， 將編碼另一蛋白 Y的 DNA序列與DNA激活域 AD的編碼序列融合形成另一個(gè)雜交體 ， 當(dāng)兩個(gè)雜交體共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞 （ 此酵母細(xì)胞上游有 DNA結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因 ） ， 若 X和 Y沒(méi)有相互作用 ， 則單獨(dú)不能激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄；若 X和 Y可相互作用 ， 則使 BD和 AD靠近形成一個(gè)有效的轉(zhuǎn)錄激活子 ， 激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄 。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過(guò)經(jīng)驗(yàn)確定。C搖動(dòng) 1h ? 5）加入 ProteinGSepharose懸液， 4186。如果用蛋白質(zhì) X的抗體免疫沉淀 X，那么與 X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì) Y也能沉淀下來(lái)。C 2h 3）離心棄上清 4）沉淀加入 2 蛋白 Loading Buffer煮沸，離心 5）取上清進(jìn)行 SDSPAGE電泳， 6）考馬氏亮蘭染色觀察特異沉降的蛋白帶，進(jìn)一步做質(zhì)譜分析確 定沉降的蛋白；電泳后的膠也可以做 Western Blot來(lái)確定沉降的蛋白中是否有目的蛋白 該實(shí)驗(yàn)設(shè)立 GST對(duì)照，反應(yīng)均在 4186。該方法只是用于確定體外的相互作用。 四免疫組織化學(xué)技術(shù) 免疫組化染色技術(shù)的分類 ? 免疫熒光法（ Immunofluorescence technique） ? 免疫酶法（ Immunoperoxidase technique） ? 免疫金銀法（（ Immunogold technique） ? ABC法（ AvidinBiotin Complex） 五 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù) 1 GST融合蛋白進(jìn)行 Pulldow實(shí)驗(yàn) （ 1）原理 細(xì)菌表達(dá)的谷胱甘肽 s－轉(zhuǎn)移酶（ GST）融合蛋白主要用于蛋白的親和純化，也可以將 GST融合蛋白作為探針，與溶液中的特異性搭檔蛋白結(jié)合，然后根據(jù)谷胱甘肽瓊脂糖球珠能夠沉淀 GST融合蛋白的能力來(lái)確定相互作用的蛋白。 ? 原理： ? 是指酶標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過(guò)抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的成色反應(yīng) ， 對(duì)相應(yīng)的抗原進(jìn)行定性 、定位和定量測(cè)定的一項(xiàng)技術(shù) 。 （ 2） 將不同時(shí)間點(diǎn)處理的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，染色步驟同上。同時(shí)用流式細(xì)胞計(jì)定量檢測(cè) TFAR19蛋白的平均熒光強(qiáng)度。 （ 5）加入 FITC標(biāo)記的 TFAR19單抗， 4176。 （ 3）加入 PBST溶液， 37176。這為研究細(xì)胞凋亡早期所發(fā)生的事件，提供了一種新的技術(shù)和指標(biāo)。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，凋亡早期 TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位早于磷脂酰絲氨酸（ PS）外翻和細(xì)胞核 DNA的片段化，提示 TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位是細(xì)胞凋亡更早期發(fā)生的事件之一。 操作過(guò)程： （ 1）直接法： 細(xì)胞 3％多聚甲醛固定和 滲透化 封閉 熒光素標(biāo)記的 抗體 洗滌 熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞計(jì)分析 （ 2）間接法： 細(xì)胞 3％多聚甲醛固定和滲透化 封閉 針對(duì)蛋白的特異 抗體 洗滌 熒光素標(biāo)記的二抗 洗滌 熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞計(jì)分析 凋亡相關(guān)蛋白 TFAR19蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位分析 ? TFAR19（ PDCD5）是由本研究室在國(guó)際上首先報(bào)導(dǎo)的一個(gè)擁有自己知識(shí)產(chǎn)權(quán)的人類新基因，前期的功能研究表明，它是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的增強(qiáng)劑。 3 爬片細(xì)胞染色：同上，最后用熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行觀察。 原理 樣本處理和染色方法 1 懸浮細(xì)胞的染色：將正常培養(yǎng)和誘導(dǎo)凋亡的懸浮細(xì)胞（ ~1 106）用 PBS洗 2次，加入 100ul Binding Buffer和FITC標(biāo)記的 AnnexinV（ 20ug/ml） 10ul，室溫避光 30min，再加入 PI（ 50ug/ml） 5ul，避光反應(yīng) 5min后，加入 400ul Binding Buffer，立即用 FACScan進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)（一般不超過(guò) 1h）， 同時(shí)以不加 AnnexinVFITC及 PI的一管作為陰性對(duì)照。 AnnexinV是一種分子量為 35~36KD的 Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。C 反應(yīng) 3060min 熒光素標(biāo)記的二抗 4186。C反應(yīng) 3060min 熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞計(jì)分析。 操作過(guò)程： 抗原包被 封閉 待檢標(biāo)本 生物素化抗體 洗滌 酶標(biāo)記親和素 洗滌 加底物顯色和檢測(cè) 三 免疫熒光技術(shù) ? 利用某些熒光素，如 FITC、 RPE等通過(guò)化學(xué)反應(yīng)與抗體或其它蛋白結(jié)合制備成熒光探針，然后與被測(cè)抗原或配體發(fā)生特異性結(jié)合，形成的熒光復(fù)合物在一定波長(zhǎng)光的激發(fā)下可產(chǎn)生熒光，因此利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測(cè)未知抗原或相應(yīng)配體。生物素化抗體可捕獲多個(gè)親和素，后者再與酶結(jié)合，加入底物后，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。 c: 加入待測(cè)血清； d: 洗滌 96孔酶標(biāo)板 e: 加入相應(yīng)抗原 f：加入抗原特異的酶標(biāo)抗體 g：洗滌 h：顯色和檢測(cè) （ 5） ABSELISA技術(shù) （ Avidin Biotin systemELISA 原理 親和素是一種分子量是 60， 000的堿性蛋白，由四個(gè)相同亞基組成，每個(gè)亞基有一個(gè)生物素分子結(jié)合點(diǎn)。然后加入相應(yīng)抗原，繼而加入針對(duì)抗原特異的酶標(biāo)抗體，再與底物作用，顏色的深淺即與標(biāo)本中的 IgM含量成正相關(guān)。 方法 a: 抗原包被 96孔酶標(biāo)板； b:封閉 。如用抗原包被的間接法直接測(cè)定血清中的 IgM抗體，因標(biāo)本中一般同時(shí)存在較高濃度的 IgG抗體，后者將競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相抗原而使一部分 IgM抗體不能結(jié)合到固相上，將出現(xiàn)假陰性結(jié)果。 方法 : a: 抗原包被 96孔板； b:封閉 。 ? 方法： 抗體包被 封閉 同時(shí)加入待測(cè)抗原和酶標(biāo)抗原 ? 洗滌 酶底物 顯色 ELISA reader檢測(cè) ? 2）抗原固相測(cè)抗原 其原理是標(biāo)本中的抗原和固