【正文】 核酸和蛋白質分析技術 第一節(jié) 核酸分析技術 ? 講述內容： 核酸電泳 雜交技術 PCR技術 基因芯片 一、核 酸 電 泳 ? （一） DNA的凝膠電泳 ? 凝膠電泳是分子克隆的中心技術之一。 1. 瓊脂糖凝膠用于分離大于 200～ 1000bp的片段 。 操作簡單、快速，且分離范圍廣，分辨率高 2. 聚丙烯酰胺凝膠用于分離 5－ 500bp的片段 。 效果好、分辨率極高，相差 1bp的 DNA片斷就能分開，能容納相對大量的 DNA 用于核苷酸多態(tài)性的分析 瓊脂糖凝膠電泳的基本過程 ? 材料 ： 電泳緩沖液（常用 TAE或 TBE）、電泳級瓊脂糖、溴化乙錠溶液（核酸顯示劑）、加樣緩沖液（保證核酸不在加樣孔中擴散和用于電泳時間的指示系統(tǒng)）、水平凝膠電泳裝置及制膠系統(tǒng)、直流電源系統(tǒng)。 ? 基本過程：制膠 放入電泳槽中并加入電泳緩沖液 取出梳子 將適量的核酸樣品和上樣緩沖液混合并上樣于加樣孔中 一定電壓條件下電泳 合適的時間后停止電泳 取出凝膠進行溴化乙錠染色 凝膠成像系統(tǒng)紫外燈下觀察并照相保存結果 ? 注意：溴化乙錠具有致癌性，操作時要帶手套 不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍 瓊脂糖濃度 （％， W/ V ) DNA分子的有效分離范圍（ kb) 影響 DNA在凝膠中遷移 速率 的因素： ? 1 DNA分子的大小 ? 2 構象 ? 3 凝膠濃度 ? 4 電壓 ? 5 緩沖液 瓊脂糖凝膠電泳檢測細胞凋亡過程中 DNA Ladder的形成 PCR產物的瓊脂 糖電泳 聚丙烯凝膠電泳的銀染結果分析 特殊的凝膠電泳 ? 倒轉電場凝膠電泳（ FIGE）：用于分離分子量 10～ 2022kb的 DNA分子； ? 鉗位均勻電場電泳（ CHEF電泳）：可分離大于 107bp的 DNA分子 基本過程同 DNA電泳一樣，但應明確一點的是，因為 RNA分子對 RNA酶的作用非常敏感，因此必須用對 RNA酶有抑制作用 DEPC水 來配置所有溶液，所有與 RNA接觸的儀器和裝置都要嚴格處理以盡量減少 RNA酶對樣品的降解；另外，因為 RNA分子有二、三級結構可以影響其電泳結果，因此電泳時應在變性劑存在下進行，常用的變性劑為甲醛和戊二醛。 （二） RNA 電 泳 二 核酸雜交技術 ? （一） Southern Blot ? 原理： 將待檢測的 DNA分子用 /不用限制性內切酶消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標記物標記的 DNA或 RNA探針進行反應。如果待檢物中含有與探針互補的序列，則二者通過堿基互補的原理進行結合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術進行檢測，從而顯示出待檢的片段及其相對大小。 用途：檢測樣品中的 DNA及其含量，了解基因的狀態(tài) , 如是否有點突變、擴增重排等。 Southern Blot 操作步驟： DNA 瓊脂糖電泳 印跡轉移 預雜交 雜交（變性探針） 洗膜 放射自顯影或顯色 ? 原理 ： 在變性條件下將待檢的 RNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳 ， 繼而按照同 Southern Blot相同的原理進行轉膜和用探針進行雜交檢測 。 ? 用途：檢測樣品中是否含有基因的轉錄產物 （ mRNA）及其含量 。 （二） Northern Blot 操作過程 mRNA提取 甲醛變性電泳 印跡轉移 預雜交 雜交（變性探針） 洗膜 放射自顯影或化學發(fā)光 （三）探針標記技術 ? 1 標記物 ： 放射性和非放射性兩種 ? 放射性： ? 非放射性： 生物素 、 地高辛素 、熒光素 ? 標記方法 ? （ 1） 切口平移法 ? （ 2）隨機引物法 ? （ 3）末端標記法 ? （ 4）單鏈 DNA探針標記 ? （ 5） 寡核苷酸探針標記法 32P、 35S和 3H 三 PCR技術 ? PCR (Polymerase chain reaction) 是用一對寡聚 DNA作為引物，通過加溫變性－退火－ DNA合成這一周期的多次循環(huán)，使目的 DNA片段得到擴增。由于這種擴增產物是以指數(shù)形式積累的，經(jīng) 25－ 30個循環(huán)后，擴增倍數(shù)可達 106。 ? Dr. Karry Mullis 1985年發(fā)明，獲 1993年度諾貝爾化學獎； 目的 : 用于擴增位于兩段已知序列之間的 DNA區(qū)段。 （一）原理： 雙鏈 DNA通過高溫變性解離成互補單鏈 DNA －－－ 變性 ↓ 與一對寡核苷酸引物（ 5’， 3’）降低溫度退火 DNA加熱變性 +引物慢慢冷卻使其結合，形象地稱為 退火 ↓ 適溫延伸 5’/3’引物形成新鏈變成 4條鏈 DNA －－ 延伸 ↓ 第二輪：變性 — 退火 — 延伸 ?呈指數(shù)增長 理論值：一輪一倍 10輪 103=1000倍 20輪 106 30 輪 109 理論 模板擴增 30輪 1ng1g 實際 模板擴增 30輪 1ng10?g ?1 Taq DNA聚合酶 ： ? 水生棲熱菌 (thermus aquaticus,Taq)的 DNA聚合酶 ? ① 5’?3’DNA聚合酶活性； ? ②無 3’?5’外切酶活性 ， ? 35輪 %錯配 ， 與原始模板有差別； ? 最適聚合酶 溫度 72℃ ，選擇 72℃ 延伸 ? 半衰期： ℃ 130min ? 95℃ 40min ? ℃ 5— 6min ? 變性溫度： ≤ 95℃ 使其在整個擴增循環(huán)中保持足夠活性 （二）基本要素 pfu DNA 聚合酶 ? 耐熱 ? 5’?3’DNA聚合酶活性 ? 3’→ 5’外切酶活性 ? 精確度： pfu Taq 但 pfu擴增效率通常比 Taq酶略差 ? 文獻報道： Taq+pfu 會起到較好效果 ? ? 2 .引物 ? 人工合成短寡核苷酸 20bp