【正文】 : : : : GGGTCTA TCAGTAAGC ? ? ? 修飾 ? 如： 32P、生物素、熒光素，不影響其效果 ? 突變： ? AGCTCCATGACCCAG ? 539。 ? 所以負鏈 Primer： 539。然后倒過來 539。 ? 上游 ~： 與其相同 ? 下游 ~： 先寫出相應(yīng)負鏈 339。 ? 負鏈 339。 ? 例如： ? IL3正鏈 ? 539。 —— 上 游 Primer ? —— 下游 Primer 負鏈 339。下游 Primer與雙鏈 DNA正鏈互補 ， 與負鏈相同 ? 正鏈 539。 （ 1） 靠近 539。 ? Dr. Karry Mullis 1985年發(fā)明，獲 1993年度諾貝爾化學(xué)獎； 目的 : 用于擴增位于兩段已知序列之間的 DNA區(qū)段。 （二） Northern Blot 操作過程 mRNA提取 甲醛變性電泳 印跡轉(zhuǎn)移 預(yù)雜交 雜交（變性探針） 洗膜 放射自顯影或化學(xué)發(fā)光 （三）探針標記技術(shù) ? 1 標記物 ： 放射性和非放射性兩種 ? 放射性： ? 非放射性： 生物素 、 地高辛素 、熒光素 ? 標記方法 ? （ 1） 切口平移法 ? （ 2）隨機引物法 ? （ 3）末端標記法 ? （ 4）單鏈 DNA探針標記 ? （ 5） 寡核苷酸探針標記法 32P、 35S和 3H 三 PCR技術(shù) ? PCR (Polymerase chain reaction) 是用一對寡聚 DNA作為引物，通過加溫變性－退火－ DNA合成這一周期的多次循環(huán)，使目的 DNA片段得到擴增。 Southern Blot 操作步驟： DNA 瓊脂糖電泳 印跡轉(zhuǎn)移 預(yù)雜交 雜交（變性探針） 洗膜 放射自顯影或顯色 ? 原理 ： 在變性條件下將待檢的 RNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳 ， 繼而按照同 Southern Blot相同的原理進行轉(zhuǎn)膜和用探針進行雜交檢測 。如果待檢物中含有與探針互補的序列，則二者通過堿基互補的原理進行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進行檢測，從而顯示出待檢的片段及其相對大小。 ? 基本過程：制膠 放入電泳槽中并加入電泳緩沖液 取出梳子 將適量的核酸樣品和上樣緩沖液混合并上樣于加樣孔中 一定電壓條件下電泳 合適的時間后停止電泳 取出凝膠進行溴化乙錠染色 凝膠成像系統(tǒng)紫外燈下觀察并照相保存結(jié)果 ? 注意：溴化乙錠具有致癌性，操作時要帶手套 不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍 瓊脂糖濃度 （％， W/ V ) DNA分子的有效分離范圍（ kb) 影響 DNA在凝膠中遷移 速率 的因素： ? 1 DNA分子的大小 ? 2 構(gòu)象 ? 3 凝膠濃度 ? 4 電壓 ? 5 緩沖液 瓊脂糖凝膠電泳檢測細胞凋亡過程中 DNA Ladder的形成 PCR產(chǎn)物的瓊脂 糖電泳 聚丙烯凝膠電泳的銀染結(jié)果分析 特殊的凝膠電泳 ? 倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳（ FIGE）：用于分離分子量 10～ 2022kb的 DNA分子； ? 鉗位均勻電場電泳（ CHEF電泳）：可分離大于 107bp的 DNA分子 基本過程同 DNA電泳一樣，但應(yīng)明確一點的是，因為 RNA分子對 RNA酶的作用非常敏感，因此必須用對 RNA酶有抑制作用 DEPC水 來配置所有溶液，所有與 RNA接觸的儀器和裝置都要嚴格處理以盡量減少 RNA酶對樣品的降解；另外，因為 RNA分子有二、三級結(jié)構(gòu)可以影響其電泳結(jié)果，因此電泳時應(yīng)在變性劑存在下進行，常用的變性劑為甲醛和戊二醛。 操作簡單、快速，且分離范圍廣，分辨率高 2. 聚丙烯酰胺凝膠用于分離 5－ 500bp的片段 。核酸和蛋白質(zhì)分析技術(shù) 第一節(jié) 核酸分析技術(shù) ? 講述內(nèi)容： 核酸電泳 雜交技術(shù) PCR技術(shù) 基因芯片 一、核 酸 電 泳 ? （一） DNA的凝膠電泳 ? 凝膠電泳是分子克隆的中心技術(shù)之一。 1. 瓊脂糖凝膠用于分離大于 200～ 1000bp的片段 。 效果好、分辨率極高，相差 1bp的 DNA片斷就能分開，能容納相對大量的 DNA 用于核苷酸多態(tài)性的分析 瓊脂糖凝膠電泳的基本過程 ? 材料 ： 電泳緩沖液（常用 TAE或 TBE）、電泳級瓊脂糖、溴化乙錠溶液（核酸顯示劑）、加樣緩沖液（保證核酸不在加樣孔中擴散和用于電泳時間的指示系統(tǒng)）、水平凝膠電泳裝置及制膠系統(tǒng)、直流電源系統(tǒng)。 （二） RNA 電 泳 二 核酸雜交技術(shù) ? （一） Southern Blot ? 原理： 將待檢測的 DNA分子用 /不用限制性內(nèi)切酶消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標記物標記的 DNA或 RNA探針進行反應(yīng)。 用途：檢測樣品中的 DNA及其含量，了解基因的狀態(tài) , 如是否有點突變、擴增重排等。 ? 用途：檢測樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 （ mRNA）及其含量 。由于這種擴增產(chǎn)物是以指數(shù)形式積累的，經(jīng) 25－ 30個循環(huán)后，擴增倍數(shù)可達 106。 （一）原理： 雙鏈 DNA通過高溫變性解離成互補單鏈 DNA －－－ 變性 ↓ 與一對寡核苷酸引物（ 5’， 3’）降低溫度退火 DNA加熱變性 +引物慢慢冷卻使其結(jié)合，形象地稱為 退火 ↓ 適溫延伸 5’/3’引物形成新鏈變成 4條鏈 DNA －－ 延伸 ↓ 第二輪：變性 — 退火 — 延伸 ?呈指數(shù)增長 理論值：一輪一倍 10輪 103=1000倍 20輪 10