【文章內(nèi)容簡介】 ........................................................................21 水稻葉片 DNA提取 .........................................................................................21 水稻轉(zhuǎn)基因再生植株潮霉素抗性檢測 ................................................................22 轉(zhuǎn)基因植株的 PCR 檢測 ...................................................................................22 .............................................................................................................. 23 新型 Bt 基因含選擇標(biāo)記農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建與鑒定 ...............................................23 含新型 Bt 基因中間載體 pUPROKCry30Fa1與 pUPROKCry54Aa1的構(gòu)建與鑒定 ................................................................................................................................23 含新型 Bt 基因雙元載體 pCDMARCry30Fa1Hyg與 pCDMARCry54Aa1Hyg的構(gòu)建與鑒定 ..................................................................................................................25 秈性水稻成熟胚 愈傷組織的獲得 ................................................................................28 抗壞血酸對秈性水稻成熟胚愈傷組織獲得的影響研究 .......................................28 繼代次數(shù)對秈性水稻成熟胚愈 傷組織獲得的影響 ..............................................29 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)新型 Bt 基因秈性水稻的獲得 .............................................................29 篩選壓對愈傷組織轉(zhuǎn)化率的影響 .......................................................................30 干燥處理對愈傷組織分化的影響 .......................................................................31 轉(zhuǎn)基因抗性植株 T0 代的檢測 ......................................................................................33 轉(zhuǎn)基因抗性植株 T0代離體葉片的潮霉素檢測 ....................................................33 轉(zhuǎn)基因再生植株 T0代的 PCR 檢測 ....................................................................34 ..................................................................................................................... 35 新型殺蟲基因 Cry30Fa1 與 Cry54Aa1 的實際應(yīng)用性 ...................................................35 秈稻愈傷組織的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化 ......................................................................36 組織培養(yǎng)過程中的褐化問題 ..............................................................................36 愈傷組織繼代次數(shù)對轉(zhuǎn)化率的影響 ...................................................................37 干燥處理對抗性愈傷組織分化的影響 ................................................................37 篩選壓對抗性愈傷組織獲得的影響 ...................................................................38 雙 TDNA 共轉(zhuǎn)化獲得去除標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植株 ......................................................38 用離體葉片檢測轉(zhuǎn)基因水稻對潮霉素抗性的可行性 ....................................................39 ................................................................................................................. 40 參考文獻(xiàn) ........................................................................................................................... 41 致謝 .................................................................................................................................. 48 附錄 .................................................................................................................................. 49 1 水稻是世界上最重要的糧食作物之一， 為 世界上近 30 億 的 人口 提供了 主要 的食物，并且 是 我 們 飲食 中 35%60%的能 量 來源 [1]。據(jù)統(tǒng)計，到 2025 年水稻產(chǎn)量需增加60%才能滿足日益增長的人口需求 [2]。因此， 在世界人口 快 速增加 和土地資源銳減 的今天，提高單位面積土地的水稻產(chǎn)量具有 非常 重要意義。 同時， 水稻也是蟲害最多的糧食作物之一，田間害蟲種類達(dá) 624 種以上，每年 僅由于螟蟲危害所造成的直接經(jīng)濟(jì)損失就達(dá) 億元，使用化學(xué)殺蟲劑防治螟蟲的費用每年達(dá) 億元，所以每年由稻螟 蟲 危害引起的總經(jīng)濟(jì)損失就能達(dá)到 億元 [3]。 我國 每年因蟲害造成的產(chǎn)量損失占水稻總產(chǎn) 量 的 5% 以上，給水稻的 生產(chǎn)帶來了極大危害。 因此，減少病蟲危害是 降低生產(chǎn)成本、 提高水稻產(chǎn)量的一個重要途徑。 長期以來，害蟲防治過多的依賴于化 學(xué)農(nóng)藥。 化學(xué)農(nóng)藥的施用在減少蟲害的同時還伴隨著一些副作用，如提高 生產(chǎn) 成本、污染 生態(tài) 環(huán)境、危害人體健康、 破壞生態(tài)系統(tǒng)、誘 導(dǎo)害蟲產(chǎn)生抗藥性、 殺死害蟲的天敵、 引起次要害蟲的大發(fā)生等，從而使 化學(xué)農(nóng)藥控制蟲害的方法在生產(chǎn)應(yīng)用受到了一定的限制。 隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，植物抗蟲基因工程 研究不斷深入，人們對農(nóng)作 物 蟲害的防治逐漸形成了新的思路與途徑。通過基因工程手段 轉(zhuǎn)入外源抗蟲基因， 培育抗蟲新品種可從根本上解決問題， 而且對哺乳動物和一些有益昆蟲不產(chǎn)生毒害作用，也 不 會 造成環(huán)境污染， 在 生產(chǎn)上 具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，人們已從植物本身 、細(xì)菌中 以及 一些動物 體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并分離 克隆 到許多抗蟲基因， 其中某些 抗蟲 基因已 轉(zhuǎn) 入 農(nóng)作物并進(jìn)行田間試驗，并有一些品種已商品化， 其中 以 轉(zhuǎn)蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白基因進(jìn)入 植物 的 研究最為廣泛和深入。 抗蟲基因的種類及特點 目前 我們 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并獲得了很多種抗蟲基因， 這些抗蟲基因 根據(jù) 來源進(jìn)行分類， 大體可以分為 以下 三類 ：第一類是從細(xì)菌如蘇云金芽孢桿菌中 分離得到的抗蟲基因，主要是 Bt 毒蛋白基因；第二類是從植物中分離出來的基因，包括 2 蛋白酶抑制劑基因，外源凝集素基因，淀粉酶抑制劑基因等；第三類是從動物體內(nèi)分離出來 的 毒素基因，如 蜘蛛毒素基因和蝎毒素基因 等 [4]。 Bt毒蛋白基因 （ 1） Bt 毒蛋白的作用機(jī)理 Bt 毒蛋白基因是水稻抗蟲基因工程中運(yùn)用最為廣泛的基因之一，它來源于一種革蘭氏陽性菌蘇云金芽孢桿菌 (Bacillus thuringensis， Bt)。蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白（ Insecticide crystal proteins， ICPs）又稱 δ內(nèi)毒素 ， 是一類在蘇云金芽孢桿菌芽孢形成期產(chǎn)生的具有特異殺蟲活性的晶體蛋白，其在伴孢晶體內(nèi)以原毒素的形式存在 。當(dāng)被昆蟲攝食之后在昆蟲 的腸道內(nèi)經(jīng)蛋白酶水解轉(zhuǎn)變?yōu)閹в心┒饲?具 有殺蟲活性的毒性多肽分子，它可與敏感昆蟲中腸上皮細(xì)胞表面的特異受體相互作用誘導(dǎo)細(xì)胞膜產(chǎn)生一些特異性小 孔擾亂細(xì)胞內(nèi)外的 滲透 壓，引起細(xì)胞膨脹甚至裂解 ， 從而導(dǎo)致昆蟲停止進(jìn)食， 最終死亡 [5]。 （ 2） Bt 毒蛋白基因分類 由于蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白基因具有多樣性， Bt 毒蛋白的基因分類一直是細(xì)菌學(xué)家 們 爭論不休的問題，直到 1975 年才正式列為一個獨立的種，種以下又根據(jù)鞭毛抗原的血清型和生理生化特征的不同分為不同的亞種，后來由于無鞭毛亞種的出現(xiàn)，又把營養(yǎng)細(xì)胞的酯酶型作為輔助分類依據(jù) [6]。據(jù)粗略統(tǒng)計，已經(jīng)有60 余種 Bt 基因被報道。 ICPs 與昆蟲腸道細(xì)胞表面受體相互作用的特異性決定了 Bt 毒蛋白的抗蟲譜。不同基因型殺蟲譜不同，毒蛋白的大小及形狀也不一樣。根據(jù)它們殺蟲譜的范圍，可將 Bt 殺蟲基因分成六大類，即 CryⅠ 、 CryⅡ 、 CryⅢ 、CryⅣ 、 CryⅤ 和 Cyt。在每一類型下根據(jù)氨基酸序列的同源性，又分為 A， B，C 等不同的基因型。在同一基因型下根據(jù)限制性內(nèi)切酶的酶譜和分子量的大小，又分為 a， b， c 等不同的基因亞型 [7]。其分類如表 [8]。 3 表 目前發(fā)現(xiàn)的一些 Bt 毒蛋白大體分類及殺蟲譜 The general classification of Bt δendotoxin found currently and insecticidal spectrum 種類 毒蛋白名稱 殺蟲范圍 CryⅠ CryIA(a) CryIA(b) CryIA(c) CryIB CryIB(b) CryIC CryID CryIE CryIF CryIG CryIX 鱗翅目 CryⅡ CryIIA CryIIB CryIIC 鱗翅目、雙翅目 CryⅢ CryⅢ A CryⅢ B CryⅢ B2 CryⅢ C CryⅢ D 鞘翅目 CryIV CryIVA CryIVB CryIVC CryIVD 雙翅目 CryV CryVA(a) CryVA(b) CryVB CryVC 鞘翅目、鱗翅目 Cyt CytA 雙翅目 蛋白酶抑制劑基因 蛋白酶抑制劑 (Proteinase Inhibitor， PI)是 植物本身起防御作用的 并且是自然界 含量最豐富的 蛋白質(zhì)種類之一，而且某些純化的蛋白酶抑制劑對昆蟲的生長和發(fā)育具有明顯地抑制作用 [9]。其抗蟲機(jī)理 是 在昆蟲的消化道內(nèi) PI 能與蛋白消化酶作 用，形成酶抑制劑復(fù)合物 (EI)，消化酶的蛋白水解作用 被阻斷或減弱 ；同時， 消化酶在 EI 的刺激下會 過量分泌，通過神經(jīng)系統(tǒng) 的反饋作用 ，使昆蟲 產(chǎn)生厭 食 反應(yīng) 或消化不良，從而 殺死昆蟲 達(dá)到抗蟲目的 [10]。在植物中 ，目前 發(fā)現(xiàn)的蛋白酶抑制劑主要有三類 :絲氨酸蛋白酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑 、巰基蛋白酶抑制劑 [11]。其中 用來抗蟲且 研究最多是絲氨酸蛋白酶抑制劑，這是因為 膜翅目、直翅目、雙翅目 以及 大部分鱗翅目和某些鞘翅目昆蟲消化道內(nèi)的消化酶 是絲氨酸蛋白酶 [12]。目前已經(jīng)有 多種植物導(dǎo)入 了 絲氨酸 蛋白酶抑制劑基因 ， 其中豇豆胰蛋白酶抑 制劑（ CpTI）是 抗蟲效果 最為有效的 絲氨酸 蛋白酶抑制劑，現(xiàn)已 有多種植物如 棉花 [13]、煙草 [14]、水稻 [15]等 導(dǎo)入了 CpTI 基因 ，