【正文】 另外， Huang 等將蜘蛛殺蟲基因轉(zhuǎn)入水稻，獲得了抗螟蟲的轉(zhuǎn)基因植株 [75]。所以 hpt 基因是 農(nóng)桿菌 介導(dǎo)的 水稻 遺傳轉(zhuǎn)化中最為有效的選擇標(biāo)記基因之一 ，而 hyg B 是一種合適的篩選劑 。王志成等認(rèn)為在懸浮浸染時加入 CaCl2 或 % Tween20 也可以提高 愈傷組織的轉(zhuǎn)化頻率 [59]。單子葉植 物之所以 比雙子葉植物難以轉(zhuǎn)化，可能是 由于單子葉植物 不能產(chǎn)生酚類物質(zhì)或者產(chǎn)生量不足以形成信號， 因此對農(nóng)桿 菌的侵染不敏感 [49]。 （ 4） Northern 雜交，它是檢測基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)情況，用特定的 DNA 探針來檢測 RNA，研究轉(zhuǎn)基因植株中外源基因 的 表達(dá)及調(diào)控 。 基因槍的價格 也很 昂貴，轉(zhuǎn)化所需成本高。水稻的成熟胚因取材不受季節(jié)環(huán)境限制，且愈傷組織轉(zhuǎn)化效率高，而被廣泛應(yīng)用于水稻的遺傳轉(zhuǎn)化。此外，幾丁質(zhì)酶基因、 豌豆脂肪氧化酶基因和核糖體失活蛋白基因 等在植物抗蟲基因工程中也具有 很大的 應(yīng)用潛力。 蛋白酶抑制劑是 從植物本身發(fā)掘的 抗蟲基因，由于 昆蟲與 人、畜在 消化機(jī) 4 制上不同， 轉(zhuǎn)入蛋白酶抑制劑基因的 食用 農(nóng) 作物對人、畜 不會產(chǎn)生 副作用 ， 因此，蛋白酶抑制劑基因 要比 其它 細(xì)菌或 動物 來源的抗蟲基因 更易于被公眾 心理上 接受 [16]。 Bt毒蛋白基因 （ 1） Bt 毒蛋白的作用機(jī)理 Bt 毒蛋白基因是水稻抗蟲基因工程中運用最為廣泛的基因之一，它來源于一種革蘭氏陽性菌蘇云金芽孢桿菌 (Bacillus thuringensis， Bt)。 Subculture media with 40 mg/L Vc could reduce the rate of callus browning with no effect on their differentiation capacity. 3. By drying callus after washing Agrobacterium and before differentiation, the system of Agrobacterium tumefaciens mediated transformation was improved. Results showed that after washing Agrobacterium and before regeneration the caulls were dried 2days on filter papers, differentiation speed was accelerated and differentiation rate was increased. 4. Agrobacterium tumefaciensmediated transformation of exogenous genes Cry30Fa1 and Cry54Aa1 into caulls of rice restorers R125 and R818, then identified gentic plants by PCR and Hyg B solution. As a result, R125 was no transgenic plants。因此，從自然界中分離克隆出更多、更有效的基因成為解決這些問題的方法之一。 秈稻是亞洲栽培稻的重要亞種，全世界水稻栽培品種中有 80%以上屬于秈稻，其組織培養(yǎng)研究具有重要意義。 R818 was only transformed into the gene of were 233 transgenic plants, but only 46 plants of them were transgenic plants identified by PCR and Hyg B solution. Key words: Indica rice。蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白（ Insecticide crystal proteins， ICPs）又稱 δ內(nèi)毒素 ， 是一類在蘇云金芽孢桿菌芽孢形成期產(chǎn)生的具有特異殺蟲活性的晶體蛋白，其在伴孢晶體內(nèi)以原毒素的形式存在 。但是，蛋白酶抑制劑基因在 植物抗蟲基因工程中 也存在不足， 其 在轉(zhuǎn)基因植物中 表達(dá)量太低，不能滿足抗蟲 所 需要 的表達(dá)量 ，因此在實際應(yīng)用中還有一定困難。 抗蟲基因存在的主要問題及解決策略 雖然 在一定程度上， 抗蟲基因轉(zhuǎn)入植物 后， 改良了某些農(nóng)藝性狀，減少了作物的蟲害，提高了產(chǎn)量，但是也存在一些的問題：（ 1）抗蟲基因的種類 雖然眾多，總體來說抗蟲譜比較廣泛，但 從 嚴(yán)格意義上來說， 每一種抗蟲基因殺蟲譜 卻相對狹 窄，如 Bt 基因種類很多，每一種 Bt 基因 都有一定 范圍 的抗蟲譜，所有種類的 Bt 基因 可以殺滅 多種害蟲，但是每 一種 Bt 基因只能殺滅一種或幾種害蟲，而且 經(jīng)過一段時間以后，昆蟲會對某些特定的抗蟲基因 產(chǎn)生耐受性，抗蟲基因的抗性不會持久；（ 2）有些抗蟲基因的表達(dá)量較低，不能達(dá)到殺蟲所需要的濃度，如 CpTI 基因?qū)胫参?后 ，只有遠(yuǎn)高于 Bt 毒蛋白 的表達(dá)濃度才能起到殺蟲作用，但是它表達(dá) 濃度 的 提高很 可能 會 對植物產(chǎn)生 某些 負(fù)面影響；（ 3）某些抗蟲基因不僅抑制或殺死害蟲，對人 、 畜也有毒性，如 某些 植物凝集素除對 害蟲有較 強(qiáng)的抑制 或殺死 作用外，對人 、 畜也有較低毒性，如 果 將這種凝集素基因 轉(zhuǎn)入農(nóng)作物 ， 則不會 被公眾所接受；（ 4） 其它種類的 抗蟲基因如 來 源于動物的抗蟲 基因 對害蟲 的 抗蟲機(jī)理仍不清楚，對它們的研究仍處于積極 探索中。水稻的幼胚與幼穗獲得的 愈傷組織雖然轉(zhuǎn)化效率很 高，但取材受季節(jié)和環(huán)境的限制， 現(xiàn)階段 應(yīng)用較少。 （ 3） PEG 法 此法是利用 高濃度 的 PEG 具有極強(qiáng)的親水性， 能 使 DNA 大分子沉淀， 促進(jìn) 水稻原生質(zhì)體與 外源 DNA 相互 靠近 并 作用 ，促使原生質(zhì)體 直接攝取外源 DNA。 （ 5） Western 雜交， 是一種 將蛋白質(zhì)電泳、印跡、免疫測定融為一體的特異蛋白質(zhì)檢測方法， 能直接顯示目標(biāo)基因在 轉(zhuǎn)化體中是否經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯，最終合成蛋白質(zhì)而影響植株的性狀表現(xiàn) ，它是檢測目標(biāo)基因在翻譯水平上的表達(dá)情況 。 Hiei 等證明100μM的乙酰丁香酮是粳稻轉(zhuǎn)化的最佳濃度的關(guān)鍵 [34]。 共培養(yǎng)環(huán)境和時間 王彩芬等認(rèn)為 在 26℃ 共培養(yǎng) 2d 的抗性愈傷組織頻率最高， 若 時間太長 ， 農(nóng)桿菌 12 難以抑制， 脫菌困難 [60]。 13 轉(zhuǎn)抗蟲 基因水稻 轉(zhuǎn) Bt基因水稻 Bt 基因是從從蘇云金芽孢桿菌中分離克隆得到的一類 抗蟲基因，它通過產(chǎn)生殺蟲晶體蛋白起到抗蟲效果， 具有 殺蟲效果好，專一性強(qiáng)，對人 、 畜無毒性等優(yōu)點，成為 水稻轉(zhuǎn) 抗蟲 基因 的首選基因。 由于轉(zhuǎn)單一抗蟲基因水稻，經(jīng)過一段時間后，昆蟲就會對其產(chǎn)生耐受性。孫小芬等獲得了轉(zhuǎn) GNA 基因的純系水稻 ，發(fā)現(xiàn)它們對褐飛虱有顯著的抑制作用 [74]。潮霉素能有效篩選水稻轉(zhuǎn)化與非轉(zhuǎn)化 的愈傷 組織，并且不易產(chǎn)生白化苗 [64]。不過 ， 向殿 軍等 認(rèn)為 將 MS 培養(yǎng)基 和 YEB 培養(yǎng)基 按 3： 1 比例混合， 用于懸浮菌體 來侵染愈傷組織 ， 不但 能較好地控制 農(nóng)桿菌 生長 ，而且愈傷轉(zhuǎn)化率也要高于單獨使用其它培養(yǎng)基 [58]。 Stachel 等 1985 年首次從煙草葉片的傷口誘出液中分離出乙酰丁香酮（ AS）和羥基乙酰丁香酮 （ HOAS），并證明這些酚類物質(zhì)能激活 Ti 質(zhì)粒上 Vir 區(qū)基因的表達(dá) [48]。 （ 3） Southern 雜交， 用特異 的 DNA 探針檢測 外源基因在植物中 的 整合位置及拷貝數(shù)等。 基因槍 法轉(zhuǎn)化 對細(xì)胞的損傷性大， 使 很 多 轉(zhuǎn)化 細(xì)胞死亡 。目前， 用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的受體主要有下列 幾種： （ 1）愈傷組織 愈傷組織 是 目前 水稻遺傳轉(zhuǎn)化 應(yīng)用最為廣泛的轉(zhuǎn)化受體 ，用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的愈傷組織大多是由水稻成熟胚、幼胚、幼穗誘導(dǎo)得到的胚性愈 傷組織。 其它抗蟲基因 膽固醇氧化酶 (Cholesterol Oxidase,cho)基因和營養(yǎng)殺蟲蛋白 (Vegetative insecticidal protein， vip)基因都是 來源于鏈 霉菌屬的第二代抗蟲基因，它們都有較強(qiáng)的殺蟲活性。目前已經(jīng)有 多種植物導(dǎo)入 了 絲氨酸 蛋白酶抑制劑基因 ， 其中豇豆胰蛋白酶抑 制劑（ CpTI）是 抗蟲效果 最為有效的 絲氨酸 蛋白酶抑制劑，現(xiàn)已 有多種植物如 棉花 [13]、煙草 [14]、水稻 [15]等 導(dǎo)入了 CpTI 基因 ，獲得的轉(zhuǎn)基因植株 對鱗翅目和鞘翅目害蟲 均具 有較好的抗蟲效果。 抗蟲基因的種類及特點 目前 我們 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并獲得了很多種抗蟲基因， 這些抗蟲基因 根據(jù) 來源進(jìn)行分類， 大體可以分為 以下 三類 ：第一類是從細(xì)菌如蘇云金芽孢桿菌中 分離得到的抗蟲基因，主要是 Bt 毒蛋白基因；第二類是從植物中分離出來的基因，包括 2 蛋白酶抑制劑基因，外源凝集素基因，淀粉酶抑制劑基因等；第三類是從動物體內(nèi)分離出來 的 毒素基因，如 蜘蛛毒素基因和蝎毒素基因 等 [4]。s population taking it as their staple food. However， insect damage is one of the main reasons to decrease the rice yield. There are a large variety of rice pests in China. The rice production loss is more than 5% of total yield because of insect damage. At present, the main method to control rice pest is to utilize chemical pesticides. However, it caused a lot of problems, such as environmental pollution, higher production cost, food safety, etc. Breeding new rice varieties that produce insecticidal proteins by themselves is undoubtedly the most economical and security strategy. On the basis of previous reports, it is difficult to solve the problem by traditional breeding because of rice germplasm resources are scarce. Given this, it is more important to use geic engineering to breed resistant rice. In recent years, pest resistant rice with Bt genes in production have already been on a wide range of applications. With largescale cultivation of insectresistant transgenic rice, Bt gene zoophobous spectrum is relatively narrow and tolerance to pests and other problems have been attracted the attention of people. Therefore, separating and cloning new pest resistant genes from the natural world became more and more effective methods to solve these problems. Indica rice is a major subspecie of Asian cultivated rice, and more than 80% of the rice cultivars in the world belongs to indica rice, so it is important significance to study tissue culture. Tissue culture of indica rice is generally poor and regeneration rate is very low, causing some production value on a large varieties of transformation are still difficult to successfully transform or frequency low. Therefore, the study of high quality indica rice callus formation and plant regeneration ability of geic transformation rate is necessary. Agrobacterium tumefaciensm