【正文】 因槍 法轉(zhuǎn)化 對(duì)細(xì)胞的損傷性大， 使 很 多 轉(zhuǎn)化 細(xì)胞死亡 。 由于該方法 可直接在田間進(jìn)行 操作，成本低， 易于 推廣 。 （ 3） Southern 雜交， 用特異 的 DNA 探針檢測(cè) 外源基因在植物中 的 整合位置及拷貝數(shù)等。因此， 對(duì) 整個(gè)遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化是獲得轉(zhuǎn)基因植株的重要條件。 Stachel 等 1985 年首次從煙草葉片的傷口誘出液中分離出乙酰丁香酮（ AS）和羥基乙酰丁香酮 （ HOAS），并證明這些酚類(lèi)物質(zhì)能激活 Ti 質(zhì)粒上 Vir 區(qū)基因的表達(dá) [48]。其中秈稻以MS[53]、 粳稻以 NB[54]作為主要的基本培養(yǎng)基。不過(guò) ， 向殿 軍等 認(rèn)為 將 MS 培養(yǎng)基 和 YEB 培養(yǎng)基 按 3： 1 比例混合， 用于懸浮菌體 來(lái)侵染愈傷組織 ， 不但 能較好地控制 農(nóng)桿菌 生長(zhǎng) ，而且愈傷轉(zhuǎn)化率也要高于單獨(dú)使用其它培養(yǎng)基 [58]。因此 篩選培養(yǎng)基中 合適 的 抗生素濃度是提高轉(zhuǎn)化效率的一個(gè)關(guān)鍵。潮霉素能有效篩選水稻轉(zhuǎn)化與非轉(zhuǎn)化 的愈傷 組織，并且不易產(chǎn)生白化苗 [64]。國(guó)際水稻所 (IRRI)Ghareyazi等 1997 年 報(bào)道了用基因槍法將 CryI(A)b 基因轉(zhuǎn)入 香粳品系 827， 檢測(cè)結(jié)果表明 Bt 毒蛋白 表達(dá)量相當(dāng)于可溶性蛋白的 ％， 而且轉(zhuǎn)基因 T2代植株 對(duì)一齡二化螟、三化螟 都 有高度抗性 [68]。孫小芬等獲得了轉(zhuǎn) GNA 基因的純系水稻 ，發(fā)現(xiàn)它們對(duì)褐飛虱有顯著的抑制作用 [74]。 轉(zhuǎn)抗蟲(chóng)基因水稻的食品安全性問(wèn)題 轉(zhuǎn)基因水稻中導(dǎo)入的外源基因通常來(lái)源于非近緣物種， 如細(xì)菌 、昆蟲(chóng) 等， 也可能是 人工合成的基因， 當(dāng)外源基因?qū)胨竞螅?除了對(duì)害蟲(chóng)產(chǎn)生作用外， 對(duì)人類(lèi)健康和 15 環(huán)境也有可能 會(huì) 產(chǎn)生影響，對(duì)人類(lèi)的安全存在潛在威脅。 由于轉(zhuǎn)單一抗蟲(chóng)基因水稻，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，昆蟲(chóng)就會(huì)對(duì)其產(chǎn)生耐受性。 其它 抗蟲(chóng)基因水稻 除 Bt 基因 外，蛋白酶抑制劑基因，植物源凝集素基因 等植物來(lái)源的抗蟲(chóng)基因和某些 動(dòng)物 來(lái) 源的 抗蟲(chóng) 基因也具有較好的抗蟲(chóng)效果。 13 轉(zhuǎn)抗蟲(chóng) 基因水稻 轉(zhuǎn) Bt基因水稻 Bt 基因是從從蘇云金芽孢桿菌中分離克隆得到的一類(lèi) 抗蟲(chóng)基因，它通過(guò)產(chǎn)生殺蟲(chóng)晶體蛋白起到抗蟲(chóng)效果， 具有 殺蟲(chóng)效果好，專一性強(qiáng)，對(duì)人 、 畜無(wú)毒性等優(yōu)點(diǎn)，成為 水稻轉(zhuǎn) 抗蟲(chóng) 基因 的首選基因。 孫建昌等研究發(fā)現(xiàn)在洗菌后愈傷組織 轉(zhuǎn)入 篩選培養(yǎng) 基 之前，對(duì)愈傷組織進(jìn)行干燥處理，可以有效地降低篩選過(guò)程中農(nóng)桿菌的過(guò)度生長(zhǎng)，起到抑菌的作用，降低污染率 ，因此采取在 超凈工作臺(tái)上吹 2h 左右至愈傷組織干燥 來(lái)抑菌 [61]。 共培養(yǎng)環(huán)境和時(shí)間 王彩芬等認(rèn)為 在 26℃ 共培養(yǎng) 2d 的抗性愈傷組織頻率最高， 若 時(shí)間太長(zhǎng) ， 農(nóng)桿菌 12 難以抑制， 脫菌困難 [60]?？梢?jiàn) ， 不同的培養(yǎng)材料對(duì)培養(yǎng)基中各種成分的需求不同 ， 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可以根據(jù)各種不同培養(yǎng)基成分的特點(diǎn)進(jìn)行搭配以組合成新的培養(yǎng)基 來(lái) 獲得較為理想的培養(yǎng)效果。 Hiei 等證明100μM的乙酰丁香酮是粳稻轉(zhuǎn)化的最佳濃度的關(guān)鍵 [34]。不同農(nóng)桿菌菌株對(duì)水稻愈傷組織的轉(zhuǎn)化能力也是不同的， Hiei 等發(fā)現(xiàn) LBA4404 效果優(yōu)于 EHA101[33]；劉巧泉等，易自力等發(fā)現(xiàn) EHA105 轉(zhuǎn)化效果優(yōu)于LBA4404 和 AGL1 菌株 [44， 45]。 （ 5） Western 雜交， 是一種 將蛋白質(zhì)電泳、印跡、免疫測(cè)定融為一體的特異蛋白質(zhì)檢測(cè)方法， 能直接顯示目標(biāo)基因在 轉(zhuǎn)化體中是否經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻譯，最終合成蛋白質(zhì)而影響植株的性狀表現(xiàn) ，它是檢測(cè)目標(biāo)基因在翻譯水平上的表達(dá)情況 。 （ 6）其他方法 朱禎 將人 α干擾素基因 應(yīng)用轉(zhuǎn)化脂介導(dǎo)法 導(dǎo)入水稻原生質(zhì)體中，獲得了轉(zhuǎn)基因植株 [39]；李寶健等運(yùn)用電注射法將外源基因直接導(dǎo)入水稻種胚，獲得轉(zhuǎn)基因植株 [40]；楊劍波等人用低能粒子束介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因水稻 [41]。 （ 3） PEG 法 此法是利用 高濃度 的 PEG 具有極強(qiáng)的親水性， 能 使 DNA 大分子沉淀， 促進(jìn) 水稻原生質(zhì)體與 外源 DNA 相互 靠近 并 作用 ，促使原生質(zhì)體 直接攝取外源 DNA。 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化 獲得的轉(zhuǎn)基因植株目的基因拷貝數(shù)少， 不易發(fā)生染色體變異，后代性狀遺傳 也比較 穩(wěn)定 。水稻的幼胚與幼穗獲得的 愈傷組織雖然轉(zhuǎn)化效率很 高，但取材受季節(jié)和環(huán)境的限制， 現(xiàn)階段 應(yīng)用較少。 目前常用的選擇標(biāo)記基因主要有 潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移基因 (hpt)、 新霉素磷 酸轉(zhuǎn)移酶基因 (nptⅡ )等 抗生素類(lèi) 選擇標(biāo)記 基因 和 抗除草劑 基因（ bar）等 。 抗蟲(chóng)基因存在的主要問(wèn)題及解決策略 雖然 在一定程度上， 抗蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)入植物 后， 改良了某些農(nóng)藝性狀，減少了作物的蟲(chóng)害，提高了產(chǎn)量，但是也存在一些的問(wèn)題：（ 1）抗蟲(chóng)基因的種類(lèi) 雖然眾多，總體來(lái)說(shuō)抗蟲(chóng)譜比較廣泛，但 從 嚴(yán)格意義上來(lái)說(shuō)， 每一種抗蟲(chóng)基因殺蟲(chóng)譜 卻相對(duì)狹 窄，如 Bt 基因種類(lèi)很多，每一種 Bt 基因 都有一定 范圍 的抗蟲(chóng)譜，所有種類(lèi)的 Bt 基因 可以殺滅 多種害蟲(chóng)，但是每 一種 Bt 基因只能殺滅一種或幾種害蟲(chóng)，而且 經(jīng)過(guò)一段時(shí)間以后，昆蟲(chóng)會(huì)對(duì)某些特定的抗蟲(chóng)基因 產(chǎn)生耐受性，抗蟲(chóng)基因的抗性不會(huì)持久；（ 2）有些抗蟲(chóng)基因的表達(dá)量較低，不能達(dá)到殺蟲(chóng)所需要的濃度，如 CpTI 基因?qū)胫参?后 ，只有遠(yuǎn)高于 Bt 毒蛋白 的表達(dá)濃度才能起到殺蟲(chóng)作用，但是它表達(dá) 濃度 的 提高很 可能 會(huì) 對(duì)植物產(chǎn)生 某些 負(fù)面影響；（ 3）某些抗蟲(chóng)基因不僅抑制或殺死害蟲(chóng)，對(duì)人 、 畜也有毒性，如 某些 植物凝集素除對(duì) 害蟲(chóng)有較 強(qiáng)的抑制 或殺死 作用外，對(duì)人 、 畜也有較低毒性，如 果 將這種凝集素基因 轉(zhuǎn)入農(nóng)作物 ， 則不會(huì) 被公眾所接受；（ 4） 其它種類(lèi)的 抗蟲(chóng)基因如 來(lái) 源于動(dòng)物的抗蟲(chóng) 基因 對(duì)害蟲(chóng) 的 抗蟲(chóng)機(jī)理仍不清楚，對(duì)它們的研究仍處于積極 探索中。 動(dòng)物來(lái)源的抗蟲(chóng)基因 在這一類(lèi)基因中，研究的較多的是來(lái) 自哺乳動(dòng)物 和煙草天蛾的蛋白酶抑制 5 劑基因。但是，蛋白酶抑制劑基因在 植物抗蟲(chóng)基因工程中 也存在不足， 其 在轉(zhuǎn)基因植物中 表達(dá)量太低，不能滿足抗蟲(chóng) 所 需要 的表達(dá)量 ，因此在實(shí)際應(yīng)用中還有一定困難。在同一基因型下根據(jù)限制性內(nèi)切酶的酶譜和分子量的大小，又分為 a， b， c 等不同的基因亞型 [7]。蘇云金芽孢桿菌殺蟲(chóng)晶體蛋白（ Insecticide crystal proteins， ICPs）又稱 δ內(nèi)毒素 ， 是一類(lèi)在蘇云金芽孢桿菌芽孢形成期產(chǎn)生的具有特異殺蟲(chóng)活性的晶體蛋白，其在伴孢晶體內(nèi)以原毒素的形式存在 。 因此，減少病蟲(chóng)危害是 降低生產(chǎn)成本、 提高水稻產(chǎn)量的一個(gè)重要途徑。 R818 was only transformed into the gene of were 233 transgenic plants, but only 46 plants of them were transgenic plants identified by PCR and Hyg B solution. Key words: Indica rice。結(jié)果表明 R125 與 R818的愈傷組織繼代 23 次，分化率最高；繼代培養(yǎng)基中加入 Vc 濃度為 40mg/L，能減少愈傷組織褐化率且對(duì)其分化能力無(wú)影響。 秈稻是亞洲栽培稻的重要亞種，全世界水稻栽培品種中有 80%以上屬于秈稻，其組織培養(yǎng)研究具有重要意義。 I 畢業(yè)論文 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化 II 摘要 水稻是世界上最重要的糧食作物之一，為約 40%的人口提供了主要食糧。因此，從自然界中分離克隆出更多、更有效的基因成為解決這些問(wèn)題的方法之一。 2. 通過(guò)對(duì)愈傷組織繼代次數(shù)與繼代培養(yǎng)基中加入抗壞血酸（ Vc）濃度的優(yōu) III 化，調(diào)整愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)，提高胚性愈傷組織數(shù)量。 Subculture media with 40 mg/L Vc could reduce the rate of callus browning with no effect on their differentiation capacity. 3. By drying callus after washing Agrobacterium and before differentiation, the system of Agrobacterium tumefaciens mediated transformation was improved. Results showed that after washing Agrobacterium and before regeneration the caulls were dried 2days on filter papers, differentiation speed was accelerated and differentiation rate was increased. 4. Agrobacterium tumefaciensmediated transformation of exogenous genes Cry30Fa1 and Cry54Aa1 into caulls of rice restorers R125 and R818, then identified gentic plants by PCR and Hyg B solution. As a result, R125 was no transgenic plants。 我國(guó) 每年因蟲(chóng)害造成的產(chǎn)量損失占水稻總產(chǎn) 量 的 5% 以上，給水稻的 生產(chǎn)帶來(lái)了極大危害。 Bt毒蛋白基因 （ 1） Bt 毒蛋白的作用機(jī)理 Bt 毒蛋白基因是水稻抗蟲(chóng)基因工程中運(yùn)用最為廣泛的基因之一，它來(lái)源于一種革蘭氏陽(yáng)性菌蘇云金芽孢桿菌 (Bacillus thuringensis， Bt)。在每一類(lèi)型下根據(jù)氨基酸序列的同源性，又分為 A， B，C 等不同的基因型。 蛋白酶抑制劑是 從植物本身發(fā)掘的 抗蟲(chóng)基因，由于 昆蟲(chóng)與 人、畜在 消化機(jī) 4 制上不同， 轉(zhuǎn)入蛋白酶抑制劑基因的 食用 農(nóng) 作物對(duì)人、畜 不會(huì)產(chǎn)生 副作用 ， 因此，蛋白酶抑制劑基因 要比 其它 細(xì)菌或 動(dòng)物 來(lái)源的抗蟲(chóng)基因 更易于被公眾 心理上 接受 [16]。因此， α淀粉酶抑制劑可作為抗蟲(chóng)基因 轉(zhuǎn)入農(nóng)作物，達(dá)到 轉(zhuǎn)基因植物自身 抗蟲(chóng) 的 目的 。此外，幾丁質(zhì)酶基因、 豌豆脂肪氧化酶基因和核糖體失活蛋白基因 等在植物抗蟲(chóng)基因工程中也具有 很大的 應(yīng)用潛力。 在構(gòu)建嵌合基因時(shí)，除啟動(dòng)子、目標(biāo)基 因和終止子外，還要加入 一個(gè) 選擇標(biāo)記基因或 報(bào)告基因 ，以便 轉(zhuǎn)基因受體的 篩選與檢測(cè) 。水稻的成熟胚因取材不受季節(jié)環(huán)境限制，且愈傷組織轉(zhuǎn)化效率高，而被廣泛應(yīng)用于水稻的遺傳轉(zhuǎn)化。Hiei 等 [33]利用此法轉(zhuǎn)化粳稻得 到了 轉(zhuǎn)基因植株 ； Rashid 等 [34]、瞿文學(xué)等 [35]應(yīng) 用此法轉(zhuǎn)化秈稻也 相繼 取得了成功， Dong 等 [36]也報(bào)道農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化爪哇稻 取得成功，這些研究都有利地證實(shí)了農(nóng)桿菌 介導(dǎo)法 轉(zhuǎn)化水稻的可行性。 基因槍的價(jià)格 也很 昂貴，轉(zhuǎn)化所需成本高。 但這一方法的轉(zhuǎn)化效率 低，操作過(guò)程還受開(kāi)花季節(jié) 限制 ，重復(fù)性差， 對(duì)后代的篩選工作量很大。 （ 4） Northern 雜交，它是檢測(cè)基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)情況，用特定的 DNA 探針來(lái)檢測(cè) RNA，研究轉(zhuǎn)基因植株中外源基因 的 表達(dá)及調(diào)控 。影響遺傳轉(zhuǎn)化體系的因素有以下幾個(gè)方面： 農(nóng)桿菌菌株與質(zhì)粒載體 目前用于水稻轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌主要菌株有 LBA440 EHA101 及 EHA10 AGL0 和 AGL1。單子葉植 物之所以 比雙子葉植物難以轉(zhuǎn)化，可能是 由于單子葉植物 不能產(chǎn)生酚類(lèi)物質(zhì)或者產(chǎn)生量不足以形成信號(hào)， 因此對(duì)農(nóng)桿 菌的侵染不敏感 [49]。馬炳田等以 N6 大量元素、 MS 微量元素 、 B5 有機(jī)成分組合成 NMB 培養(yǎng)基 ， 對(duì)幾個(gè)雜交秈稻親本品種的成熟胚進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo) ， 獲得了較高的誘導(dǎo)率 [55]。王志成等認(rèn)為在懸浮浸染時(shí)加入 CaCl2 或 % Tween20 也可以提高 愈傷組織的轉(zhuǎn)化頻率 [59]。 向殿軍 等 采用將共培養(yǎng)后的愈傷組織 洗菌并 干燥 3d 進(jìn)行抑 菌 ，轉(zhuǎn)化率均高于 培養(yǎng)基加 抗生素 抑 菌 [55]。所以 hpt 基因是 農(nóng)桿菌 介導(dǎo)的 水稻 遺傳轉(zhuǎn)化中最為有效的選擇標(biāo)記基因之一 ，而 hyg B 是一種合適的篩選劑 。 1998 年浙江大學(xué)和加拿大渥太華大學(xué)將經(jīng)過(guò)密碼子 優(yōu)化的 CryI(A)b 基因 通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法 導(dǎo)入粳稻秀水 11 中，獲得的 KMD1 和 KMD2“克螟稻 ”株系 ，轉(zhuǎn)基因 R4 代植株 對(duì) 抗二化螟和三化螟 具有高抗性 ，其中 KMDI 株系的每 代 轉(zhuǎn)基因 植株 對(duì) 二化螟 、三化螟、稻縱卷葉螟和大螟等 8 種水稻害蟲(chóng) 都有抗性且對(duì) 初孵幼蟲(chóng)的致死率高達(dá) 100％ [69]。另外， Huang 等將蜘蛛殺蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)入水稻，獲得了抗螟蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因植株 [75]。 由于在轉(zhuǎn)基因水稻中，除插入基因及其表達(dá)產(chǎn)物外，由外源基因表達(dá)產(chǎn)物引起的次級(jí)效應(yīng)及基因隨機(jī)插入引起的位置效應(yīng)，有可能會(huì)產(chǎn)生 對(duì)人、畜 有害的成分 [78]，而且，在 轉(zhuǎn)入抗蟲(chóng) 目的基因 的同時(shí) 還轉(zhuǎn)入了 報(bào)告基因和選擇 性標(biāo)記基因，這些基因表達(dá)產(chǎn)物的安全性目前尚無(wú)定論 [