【導(dǎo)讀】水稻是世界上最重要的糧食作物之一，為約40%的人口提供了主要食糧。造成水稻減產(chǎn)減收的主要原因之一。水稻蟲(chóng)害種類繁多，我國(guó)每年因蟲(chóng)害造成的產(chǎn)量。損失占到水稻總產(chǎn)量的5%以上，給水稻的生產(chǎn)帶來(lái)了極大危害。水稻蟲(chóng)害最主要的方法是使用化學(xué)殺蟲(chóng)劑，但化學(xué)防治帶來(lái)一系列問(wèn)題，如環(huán)境污染，生產(chǎn)成本提高和食用安全性降低等。因此，通過(guò)培育自身能夠抵抗蟲(chóng)害的水稻品種來(lái)。防治水稻蟲(chóng)害無(wú)疑是最經(jīng)濟(jì)安全的有效策略。從已有的研究來(lái)看，僅依靠常規(guī)育種難。培育抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因水稻越來(lái)越受到人們的重視。愈傷組織形成和植株再生能力對(duì)于遺傳轉(zhuǎn)化率提高十分必要。測(cè)序鑒定得到序列正確的陽(yáng)性載體，化，調(diào)整愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)，提高胚性愈傷組織數(shù)量。能減少愈傷組織褐化率且對(duì)其分化能力無(wú)影響。結(jié)果表明洗菌后進(jìn)行干燥及分化前愈傷組織在濾紙上干燥2天，R818中，通過(guò)PCR檢測(cè)與潮霉素溶液檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株。測(cè)，其中46株為含目的基因的陽(yáng)性植株。

　　

【正文】 （ 3） Southern 雜交， 用特異 的 DNA 探針檢測(cè) 外源基因在植物中 的 整合位置及拷貝數(shù)等。 （ 4） Northern 雜交，它是檢測(cè)基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)情況，用特定的 DNA 探針來(lái)檢測(cè) RNA，研究轉(zhuǎn)基因植株中外源基因 的 表達(dá)及調(diào)控 。 （ 5） Western 雜交， 是一種 將蛋白質(zhì)電泳、印跡、免疫測(cè)定融為一體的特異蛋白質(zhì)檢測(cè)方法， 能直接顯示目標(biāo)基因在 轉(zhuǎn)化體中是否經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻譯，最終合成蛋白質(zhì)而影響植株的性狀表現(xiàn) ，它是檢測(cè)目標(biāo)基因在翻譯水平上的表達(dá)情況 。 農(nóng)桿菌介導(dǎo) 的 水稻遺傳轉(zhuǎn)化 的 研究 Baba 等 于 1986 年 通過(guò) PEG 法 將農(nóng)桿菌原生質(zhì) 與水稻原生質(zhì)體介導(dǎo)融合，獲得能 表達(dá) 胭脂堿的水稻愈傷組織 [42]，自此人們 開(kāi)始了對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化 水稻廣泛的研 10 究。 Chan 等 成功 獲得 了 可遺傳的農(nóng)桿菌 介導(dǎo)的 轉(zhuǎn)化水稻植株 [43]。隨后， Hiei等 通過(guò)利用 “超雙元 ”載體 和在共培養(yǎng)基中加入乙酰丁香酮等 改良了 轉(zhuǎn)化條件 ， 從而 提高了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化頻率 [33]。 至此， 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得突破性進(jìn)展并 日益 成熟。 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化是農(nóng)桿菌菌株與轉(zhuǎn)化受體 細(xì)胞之間的相互作用， 與愈傷組織的培養(yǎng)及農(nóng)桿菌的侵染轉(zhuǎn)化過(guò)程有關(guān)的 影響 因素，都會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)化效果產(chǎn)生影響。因此， 對(duì) 整個(gè)遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化是獲得轉(zhuǎn)基因植株的重要條件。影響遺傳轉(zhuǎn)化體系的因素有以下幾個(gè)方面： 農(nóng)桿菌菌株與質(zhì)粒載體 目前用于水稻轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌主要菌株有 LBA440 EHA101 及 EHA10 AGL0 和 AGL1。不同農(nóng)桿菌菌株對(duì)水稻愈傷組織的轉(zhuǎn)化能力也是不同的， Hiei 等發(fā)現(xiàn) LBA4404 效果優(yōu)于 EHA101[33]；劉巧泉等，易自力等發(fā)現(xiàn) EHA105 轉(zhuǎn)化效果優(yōu)于LBA4404 和 AGL1 菌株 [44， 45]。王歆等認(rèn)為 EHA105 轉(zhuǎn)化效果優(yōu)于 AGL0[46]。 在粳稻遺傳轉(zhuǎn)化中， Hiei 等人研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用超雙元載體比用雙元載體有更大的優(yōu)越性 [33]。 Ramesh 等研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用農(nóng)桿菌超雙元 Ti 質(zhì)粒載體能轉(zhuǎn)化難以轉(zhuǎn)化的秈稻品種 [47]。 因此，采用超毒力的農(nóng)桿菌菌株和超雙元載體 ，能夠增強(qiáng)農(nóng)桿 菌的侵染能力和 TDNA 的整合能力 ， 較好地 克服 了 包括水稻在內(nèi)的單子葉植物對(duì)農(nóng)桿菌敏感性差的問(wèn)題。 農(nóng)桿菌 Vir區(qū)基因活性的誘導(dǎo) 目前，在水稻遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中，對(duì)農(nóng)桿菌 vir 區(qū)基因活性的誘導(dǎo)應(yīng)用較多的是乙酰丁香酮。 Stachel 等 1985 年首次從煙草葉片的傷口誘出液中分離出乙酰丁香酮（ AS）和羥基乙酰丁香酮 （ HOAS），并證明這些酚類物質(zhì)能激活 Ti 質(zhì)粒上 Vir 區(qū)基因的表達(dá) [48]。單子葉植 物之所以 比雙子葉植物難以轉(zhuǎn)化，可能是 由于單子葉植物 不能產(chǎn)生酚類物質(zhì)或者產(chǎn)生量不足以形成信號(hào)， 因此對(duì)農(nóng)桿 菌的侵染不敏感 [49]。 Hiei 等證明100μM的乙酰丁香酮是粳稻轉(zhuǎn)化的最佳濃度的關(guān)鍵 [34]。 而 Hoque 等研究孟加拉稻轉(zhuǎn)化時(shí)卻發(fā)現(xiàn) 200μM 乙酰丁香酮轉(zhuǎn)化效率最高 [50]。據(jù)此可以判斷， 不同水稻品種使用的最佳 AS 濃度存在差異。此外， 侵染過(guò)程中加入 肌醇、較高濃度的糖類、較低濃 11 度的 pH 值和較低的共培養(yǎng)溫度 等 也有利于 vir 基因的誘導(dǎo) [51]。 培養(yǎng)基成分 培養(yǎng)基中 各種成分含量的不同對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)至關(guān)重要，因此， 選擇恰當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基是 良好 愈傷組織 的 獲得， 農(nóng)桿菌介導(dǎo) 遺傳轉(zhuǎn)化 的成功 與 轉(zhuǎn)基因 植 株 再生的基礎(chǔ)條件。 目前在水稻組織培養(yǎng)使用的基本培養(yǎng)基有 NB、 MS、 N B5 等 [52]。其中秈稻以MS[53]、 粳稻以 NB[54]作為主要的基本培養(yǎng)基。馬炳田等以 N6 大量元素、 MS 微量元素 、 B5 有機(jī)成分組合成 NMB 培養(yǎng)基 ， 對(duì)幾個(gè)雜交秈稻親本品種的成熟胚進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo) ， 獲得了較高的誘導(dǎo)率 [55]?？梢?jiàn) ， 不同的培養(yǎng)材料對(duì)培養(yǎng)基中各種成分的需求不同 ， 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可以根據(jù)各種不同培養(yǎng)基成分的特點(diǎn)進(jìn)行搭配以組合成新的培養(yǎng)基 來(lái) 獲得較為理想的培養(yǎng)效果。 愈傷組織的預(yù)處理 Stanton 認(rèn)為當(dāng)愈傷組織細(xì) 胞 中 處于細(xì)胞周期 間期 S 和 G2 期的 胚性愈傷組織 比例 最 高時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高 [56]。因?yàn)?細(xì)胞分裂間期染色體解螺旋，以染色質(zhì)形式存在， 且S 期是細(xì)胞 DNA 復(fù)制期，此時(shí)轉(zhuǎn)化有利于 TDNA 插入水稻基因組中 ，增加 遺傳 穩(wěn)定 性。 鄭杰認(rèn)為繼代培養(yǎng) 67d 的愈傷組織用于轉(zhuǎn)化時(shí)轉(zhuǎn)化率最高 [57]。 因此對(duì)愈傷組織進(jìn)行適當(dāng)?shù)睦^代和預(yù)培養(yǎng)，可增加胚性愈傷組織比例，提高轉(zhuǎn)化率。 農(nóng)桿菌懸浮 侵 染 環(huán)境 不同的懸浮侵 染環(huán)境對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響是比較大的， 在大多數(shù)的轉(zhuǎn)化方法中農(nóng)桿菌懸 浮 于 AAM 培養(yǎng)基中用于侵染愈傷組織。不過(guò) ， 向殿 軍等 認(rèn)為 將 MS 培養(yǎng)基 和 YEB 培養(yǎng)基 按 3： 1 比例混合， 用于懸浮菌體 來(lái)侵染愈傷組織 ， 不但 能較好地控制 農(nóng)桿菌 生長(zhǎng) ，而且愈傷轉(zhuǎn)化率也要高于單獨(dú)使用其它培養(yǎng)基 [58]。王志成等認(rèn)為在懸浮浸染時(shí)加入 CaCl2 或 % Tween20 也可以提高 愈傷組織的轉(zhuǎn)化頻率 [59]。 共培養(yǎng)環(huán)境和時(shí)間 王彩芬等認(rèn)為 在 26℃ 共培養(yǎng) 2d 的抗性愈傷組織頻率最高， 若 時(shí)間太長(zhǎng) ， 農(nóng)桿菌 12 難以抑制， 脫菌困難 [60]。孫建昌等認(rèn)為在 22℃ 共培養(yǎng) 3d 后 ， 獲得的抗性愈傷組織最多，效果最好 [61]。王志成等認(rèn)為在 共培養(yǎng)的 培養(yǎng)基上覆 蓋 1 張干燥 無(wú)菌 濾紙 ,將愈傷組織放置在濾紙上以后再在愈傷組織周圍滴加 12 滴 AAM 培養(yǎng)基的共培養(yǎng)方式為最佳 [56]。 共培養(yǎng)后農(nóng)桿菌的抑制 農(nóng)桿菌與愈傷組織共培養(yǎng)后農(nóng)桿菌的去除與抑制對(duì)轉(zhuǎn)化效率有著極大地影響。目前常用的方法是用滅菌蒸餾水洗脫并在最后幾次洗脫時(shí)加入抗生素抑制 ，同時(shí)在篩選培養(yǎng)基中加入抗生素抑制 。共培養(yǎng)后農(nóng)桿菌用小劑量的抗生素難以除去，加大劑量雖然能有效地除去農(nóng)桿菌，卻嚴(yán) 重?fù)p害了愈傷組織 導(dǎo)致 愈傷組織的 褐化死亡，影響轉(zhuǎn)化率。因此 篩選培養(yǎng)基中 合適 的 抗生素濃度是提高轉(zhuǎn)化效率的一個(gè)關(guān)鍵。 向殿軍 等 采用將共培養(yǎng)后的愈傷組織 洗菌并 干燥 3d 進(jìn)行抑 菌 ，轉(zhuǎn)化率均高于 培養(yǎng)基加 抗生素 抑 菌 [55]。 孫建昌等研究發(fā)現(xiàn)在洗菌后愈傷組織 轉(zhuǎn)入 篩選培養(yǎng) 基 之前，對(duì)愈傷組織進(jìn)行干燥處理，可以有效地降低篩選過(guò)程中農(nóng)桿菌的過(guò)度生長(zhǎng)，起到抑菌的作用，降低污染率 ，因此采取在 超凈工作臺(tái)上吹 2h 左右至愈傷組織干燥 來(lái)抑菌 [61]。 石少華等通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌的耐受溫度低于 38℃ ，水稻愈傷組織培養(yǎng)溫度可以高于 38℃ ，從而設(shè)想在農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)行水稻遺傳轉(zhuǎn)化操作中，采用高溫培養(yǎng)愈傷組織抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)，從而少加或不加抗生素 [62]。 篩選標(biāo)記基因以及篩選劑的選擇 在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化中，成功的篩選就是能有效地區(qū)分轉(zhuǎn)化成功與非成功的愈傷組織，并 產(chǎn)生較少的假陽(yáng)性植株。因此， 在構(gòu)建載體時(shí)要選擇合適的篩選標(biāo)記基因， 在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化后 確定相適應(yīng)的 篩選劑，篩選濃度及篩選時(shí)間。 易自力等人 通過(guò)比較 3 種篩選劑的作用效果，結(jié)果表明 秈稻品種的篩選以 hyg B作為篩選劑 最適合 [46]。周玲艷等人也比較了 hyg B 和 PPT 對(duì)愈傷組織的篩選的效果 ，結(jié)果表明 hyg B 篩選效果更好 [63]。潮霉素能有效篩選水稻轉(zhuǎn)化與非轉(zhuǎn)化 的愈傷 組織，并且不易產(chǎn)生白化苗 [64]。所以 hpt 基因是 農(nóng)桿菌 介導(dǎo)的 水稻 遺傳轉(zhuǎn)化中最為有效的選擇標(biāo)記基因之一 ，而 hyg B 是一種合適的篩選劑 。 13 轉(zhuǎn)抗蟲(chóng) 基因水稻 轉(zhuǎn) Bt基因水稻 Bt 基因是從從蘇云金芽孢桿菌中分離克隆得到的一類 抗蟲(chóng)基因，它通過(guò)產(chǎn)生殺蟲(chóng)晶體蛋白起到抗蟲(chóng)效果， 具有 殺蟲(chóng)效果好，專一性強(qiáng)，對(duì)人 、 畜無(wú)毒性等優(yōu)點(diǎn)，成為 水稻轉(zhuǎn) 抗蟲(chóng) 基因 的首選基因。 自 80 年代以來(lái) ， 國(guó)內(nèi)外 學(xué)者 對(duì) 轉(zhuǎn) Bt 抗蟲(chóng) 基因 水稻育種 的 研究經(jīng)歷了應(yīng)用野生型Bt 基因 、 對(duì) Bt 基因進(jìn)行修飾和啟動(dòng)子選擇 三個(gè) 階段 ， 逐步提高了轉(zhuǎn)基因水稻的抗蟲(chóng)水平。 楊虹等 在 1989 年 通過(guò) 電融合技術(shù) 將 Bt 基因?qū)胨九_(tái)粳 209 的原生質(zhì)體中[65]。謝道昕 等 1991 年 用花粉管通道技術(shù)將 Bt 基因?qū)胨局谢?11 號(hào) 中 [38]，楊虹、謝道昕 等 轉(zhuǎn)化 所用 Bt 基因是直接從蘇云金 芽孢 桿菌中分離克隆 得到的，經(jīng)分子生物學(xué)方法 檢測(cè)證明 Bt 基因已 成功 整合到水稻基因組中。日本科學(xué)家 Fujimoto 等 1993年 通過(guò)電激法將 修飾的 Bt 基因 CryI(A)b 轉(zhuǎn)入 粳稻 原生質(zhì)體 中 ， 檢測(cè) 結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株中 Bt 蛋白 總量占可溶性 蛋白 總量 的 ％， 說(shuō)明 Bt 基因 在轉(zhuǎn)基因植株中 得到了 高效表達(dá) [66]。瑞士蘇黎士植物科學(xué)研究所 Wunn 等 1996 年 用基因槍法將 CryI(A)b基因?qū)攵i稻 IR58， 并且轉(zhuǎn)基因植株及其后代對(duì)鱗翅目水稻 害蟲(chóng)有明顯殺蟲(chóng)效果 [67]。國(guó)際水稻所 (IRRI)Ghareyazi等 1997 年 報(bào)道了用基因槍法將 CryI(A)b 基因轉(zhuǎn)入 香粳品系 827， 檢測(cè)結(jié)果表明 Bt 毒蛋白 表達(dá)量相當(dāng)于可溶性蛋白的 ％， 而且轉(zhuǎn)基因 T2代植株 對(duì)一齡二化螟、三化螟 都 有高度抗性 [68]。 1998 年浙江大學(xué)和加拿大渥太華大學(xué)將經(jīng)過(guò)密碼子 優(yōu)化的 CryI(A)b 基因 通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法 導(dǎo)入粳稻秀水 11 中，獲得的 KMD1 和 KMD2“克螟稻 ”株系 ，轉(zhuǎn)基因 R4 代植株 對(duì) 抗二化螟和三化螟 具有高抗性 ，其中 KMDI 株系的每 代 轉(zhuǎn)基因 植株 對(duì) 二化螟 、三化螟、稻縱卷葉螟和大螟等 8 種水稻害蟲(chóng) 都有抗性且對(duì) 初孵幼蟲(chóng)的致死率高達(dá) 100％ [69]。 其它 抗蟲(chóng)基因水稻 除 Bt 基因 外，蛋白酶抑制劑基因，植物源凝集素基因 等植物來(lái)源的抗蟲(chóng)基因和某些 動(dòng)物 來(lái) 源的 抗蟲(chóng) 基因也具有較好的抗蟲(chóng)效果。美國(guó)康奈爾大學(xué) 早在 1993 年就通過(guò) 直接轉(zhuǎn)化法將 CpTI 基因 導(dǎo)入水稻并獲得 了轉(zhuǎn)基因植株，生測(cè)試驗(yàn)表明轉(zhuǎn)基因植株 14 對(duì)二化螟和 三化螟 都 具有一定的抗 性 [15]。中科院遺傳與發(fā)育生物 學(xué)研究所 將 修飾的CpTI 基因 (signalCpTIKEDL， sck)轉(zhuǎn)入水稻， 成功 轉(zhuǎn) sck 的 水稻表現(xiàn)出抗蟲(chóng)能力的提高 [70]。 Xu 等通過(guò) 基因槍法將馬鈴薯蛋白酶抑制劑基因轉(zhuǎn)入水稻， 得到的轉(zhuǎn)基因水稻抗蟲(chóng)性 明顯 提高 [71]。 Hosoyama 等 1995 年 將 巰 基蛋白酶抑制劑基因?qū)胨荆?得到轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出巰 基蛋白酶抑制劑活性 ，有一定抗蟲(chóng)性 [72]。 Rao 等 1998 年 將 雪花蓮?fù)庠茨兀?GNA） 基因 轉(zhuǎn)入水稻， 在轉(zhuǎn)基因水稻 中的 表達(dá) 產(chǎn)物能夠 抑制褐飛虱的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖 [73]。孫小芬等獲得了轉(zhuǎn) GNA 基因的純系水稻 ，發(fā)現(xiàn)它們對(duì)褐飛虱有顯著的抑制作用 [74]。另外， Huang 等將蜘蛛殺蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)入水稻，獲得了抗螟蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因植株 [75]。 由于轉(zhuǎn)單一抗蟲(chóng)基因水稻，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，昆蟲(chóng)就會(huì)對(duì)其產(chǎn)生耐受性。 針對(duì)此種情況， 許多國(guó)家的科研單位對(duì)此作了比較深入的研究和探索 ，發(fā)現(xiàn) 轉(zhuǎn)雙價(jià) 或多價(jià) 抗蟲(chóng)基因 的植物 ， 抗蟲(chóng)性 和 抗蟲(chóng)譜 明顯增加 ，這作為一個(gè)新的抗蟲(chóng)研究思路 迅速 發(fā)展 。近年來(lái)，我國(guó)的 科學(xué)工作者在這一領(lǐng)域 也 進(jìn)行了較 多的驗(yàn)證和探索。 戴順洪等 通過(guò)基因槍法將 三個(gè) 含有不同 抗蟲(chóng) 基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)入水稻， 成功 獲得 轉(zhuǎn) 基因 植株 [76]；項(xiàng)友斌等將含 CryIA(b)和 CryIA(c)抗蟲(chóng)基因 的 雙元載體分別 導(dǎo)入秈 稻、 粳 稻 的 幼穗愈傷組織 中，得到了 100%的共整合水稻 [69]； 李永春等用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將 含 CryIA(c)和 CpTI 抗蟲(chóng) 基因 的雙價(jià) 載體轉(zhuǎn)入 水稻 愈傷組織， 得到的轉(zhuǎn)基因植株 抗蟲(chóng)鑒定表明對(duì)二化螟有很高的毒性 [77]。 轉(zhuǎn) 抗蟲(chóng) 基因水稻安全性研究 轉(zhuǎn)抗蟲(chóng)基因 水稻 不僅 減輕 了 化學(xué)農(nóng)藥造成的環(huán)境污染，還 可 以 提高水稻產(chǎn)量，降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展 ， 因此， 具有廣闊的應(yīng)用前景 。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于轉(zhuǎn) 抗蟲(chóng) 基因水稻安全性的研究 主要集中在 食品安全性 和生態(tài)安全性 方面 ， 并 取得 了 一 些進(jìn)展，但仍存在許多未知領(lǐng)域， 所以，我們也不能否認(rèn)其潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。 轉(zhuǎn)抗蟲(chóng)基因水稻的食品安全性問(wèn)題 轉(zhuǎn)基因水稻中導(dǎo)入的外源基因通常來(lái)源于非近緣物種， 如細(xì)菌 、昆蟲(chóng) 等， 也可能是 人工合成的基因， 當(dāng)外源基因?qū)胨竞螅?除了對(duì)害蟲(chóng)產(chǎn)生作用外， 對(duì)人類健康和 15 環(huán)境也有可能 會(huì) 產(chǎn)生影響，對(duì)人類的安全存在潛在威脅。 由于在轉(zhuǎn)基因水稻中，除插入基因及其表達(dá)產(chǎn)物外，由外源基因表達(dá)產(chǎn)物引起的次級(jí)效應(yīng)及基因隨機(jī)插入引起的位置效應(yīng)，有可能會(huì)產(chǎn)生 對(duì)人、畜 有害的成分 [78]，而且，在 轉(zhuǎn)入抗蟲(chóng) 目的基因 的同時(shí) 還轉(zhuǎn)入了 報(bào)告基因和選擇 性標(biāo)記基因，這些基因表達(dá)產(chǎn)物的安全性目前尚無(wú)定論