【正文】 .................................................................................... 16 實驗材料 ...................................................................................................................16 供試水稻品種 ...................................................................................................16 菌株和質(zhì)粒 ......................................................................................................16 培養(yǎng)基 .............................................................................................................16 化學(xué)試劑 ..........................................................................................................17 重要儀器設(shè)備 ...................................................................................................18 實驗方法 ...................................................................................................................18 VIII 載體的構(gòu)建與鑒定 ............................................................................................18 重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 .....................................................................................19 胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及繼代 ..............................................................................20 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化 .....................................................................................20 轉(zhuǎn)基因植株再生 ...............................................................................................21 結(jié)果統(tǒng)計方法 ...................................................................................................21 水稻葉片 DNA提取 .........................................................................................21 水稻轉(zhuǎn)基因再生植株潮霉素抗性檢測 ................................................................22 轉(zhuǎn)基因植株的 PCR 檢測 ...................................................................................22 .............................................................................................................. 23 新型 Bt 基因含選擇標(biāo)記農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建與鑒定 ...............................................23 含新型 Bt 基因中間載體 pUPROKCry30Fa1與 pUPROKCry54Aa1的構(gòu)建與鑒定 ................................................................................................................................23 含新型 Bt 基因雙元載體 pCDMARCry30Fa1Hyg與 pCDMARCry54Aa1Hyg的構(gòu)建與鑒定 ..................................................................................................................25 秈性水稻成熟胚 愈傷組織的獲得 ................................................................................28 抗壞血酸對秈性水稻成熟胚愈傷組織獲得的影響研究 .......................................28 繼代次數(shù)對秈性水稻成熟胚愈 傷組織獲得的影響 ..............................................29 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)新型 Bt 基因秈性水稻的獲得 .............................................................29 篩選壓對愈傷組織轉(zhuǎn)化率的影響 .......................................................................30 干燥處理對愈傷組織分化的影響 .......................................................................31 轉(zhuǎn)基因抗性植株 T0 代的檢測 ......................................................................................33 轉(zhuǎn)基因抗性植株 T0代離體葉片的潮霉素檢測 ....................................................33 轉(zhuǎn)基因再生植株 T0代的 PCR 檢測 ....................................................................34 ..................................................................................................................... 35 新型殺蟲基因 Cry30Fa1 與 Cry54Aa1 的實際應(yīng)用性 ...................................................35 秈稻愈傷組織的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化 ......................................................................36 組織培養(yǎng)過程中的褐化問題 ..............................................................................36 愈傷組織繼代次數(shù)對轉(zhuǎn)化率的影響 ...................................................................37 干燥處理對抗性愈傷組織分化的影響 ................................................................37 篩選壓對抗性愈傷組織獲得的影響 ...................................................................38 雙 TDNA 共轉(zhuǎn)化獲得去除標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植株 ......................................................38 用離體葉片檢測轉(zhuǎn)基因水稻對潮霉素抗性的可行性 ....................................................39 ................................................................................................................. 40 參考文獻(xiàn) ........................................................................................................................... 41 致謝 .................................................................................................................................. 48 附錄 .................................................................................................................................. 49 1 水稻是世界上最重要的糧食作物之一， 為 世界上近 30 億 的 人口 提供了 主要 的食物，并且 是 我 們 飲食 中 35%60%的能 量 來源 [1]。 4. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源基因 Cry30Fa1 與 Cry54Aa1 轉(zhuǎn)入三系恢復(fù)系 R125 與R818 中，通過 PCR 檢測與潮霉素溶液檢測轉(zhuǎn)基因植株。然而，水稻不同品種間遺傳差異性比較大，且轉(zhuǎn)化反應(yīng)對水稻基因型依賴性強(qiáng)，從而增加了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化的復(fù)雜性和隨機(jī)性。目前，我國控制水稻蟲害最主要的方法是使用化學(xué)殺蟲劑，但化學(xué)防治帶來一系列問題，如環(huán)境污染，生產(chǎn)成本提高和食用安全性降低等。因此，通過培育自身能夠抵抗蟲害的水稻品種來防治水稻蟲害無疑是最經(jīng)濟(jì)安全的有效策略。因此，通過對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化提高轉(zhuǎn)化率十分必要。結(jié)果表明 Cry30Fa1 與Cry54Aa1 轉(zhuǎn) R125 未獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株； Cry54Aa1 轉(zhuǎn) R818 也未獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株； Cry30Fa1 轉(zhuǎn) R818 共獲得 233 株轉(zhuǎn)基因再生植株，經(jīng)過潮霉素溶液檢測和分子檢測，其中 46 株為含目的基因的陽性植株。據(jù)統(tǒng)計，到 2025 年水稻產(chǎn)量需增加60%才能滿足日益增長的人口需求 [2]。通過基因工程手段 轉(zhuǎn)入外源抗蟲基因， 培育抗蟲新品種可從根本上解決問題， 而且對哺乳動物和一些有益昆蟲不產(chǎn)生毒害作用，也 不 會 造成環(huán)境污染， 在 生產(chǎn)上 具有廣闊的應(yīng)用前景。 ICPs 與昆蟲腸道細(xì)胞表面受體相互作用的特異性決定了 Bt 毒蛋白的抗蟲譜。在植物中 ，目前 發(fā)現(xiàn)的蛋白酶抑制劑主要有三類 :絲氨酸蛋白酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑 、巰基蛋白酶抑制劑 [11]。 轉(zhuǎn)植物凝集 素 基因 的農(nóng) 作物雖然能夠抗蟲，但是有些對人也有毒害作用，然而雪花蓮?fù)庠茨?基因 （ GNA） [19]和豌豆外源凝集素 基因 （ Pea lectin） [20] 因為對人、畜不產(chǎn)生毒性或毒性很低， 已被 成功轉(zhuǎn)入煙草和馬鈴薯等多種作物中，結(jié)果表明抗蟲效果良好， 因此受到人們的重視 [21]。另一類研究較多的是 蝎和蜘蛛產(chǎn)生的毒素，這些毒素能專一的作用于昆蟲而對哺乳動物 則 無害或毒性很低。 外源基因整合到受體植物中能夠 高 效 表達(dá)的最重要的條件 之一就是要有一個強(qiáng)啟動子序列 。 在根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的 水稻 遺傳轉(zhuǎn)化中，所 用載體 大多數(shù) 為雙 TDNA 載體 ，其中一個 TDNA 含有目的基因，另一個 TDNA 含有標(biāo)記基因或報告基因， 以便于 轉(zhuǎn)目的基因受體的篩選與檢測及 轉(zhuǎn)基因后代 選擇標(biāo)記基因 的去除 。 8 轉(zhuǎn)化方法 （ 1）農(nóng)桿菌介導(dǎo)法 此方法 自 Zembryski 等利用農(nóng)桿菌 介導(dǎo)法 轉(zhuǎn)化煙草獲得首例轉(zhuǎn)基因植株 后 [32]，逐漸得到推廣。 目前已有大量的水稻品種 采用此 法 轉(zhuǎn)外源基因 獲得了成功。 （ 5）花粉管通道法 此方法是將 外源 DNA 分子 在授粉后注射入 花粉管 ， 然后 9 沿著花粉管通道 進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化 未成熟的 卵 細(xì)胞 ， 進(jìn)而借助天然種胚系統(tǒng)形成轉(zhuǎn)基因