【正文】 戴順洪等 通過基因槍法將 三個(gè) 含有不同 抗蟲 基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)入水稻， 成功 獲得 轉(zhuǎn) 基因 植株 [76]；項(xiàng)友斌等將含 CryIA(b)和 CryIA(c)抗蟲基因 的 雙元載體分別 導(dǎo)入秈 稻、 粳 稻 的 幼穗愈傷組織 中，得到了 100%的共整合水稻 [69]； 李永春等用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將 含 CryIA(c)和 CpTI 抗蟲 基因 的雙價(jià) 載體轉(zhuǎn)入 水稻 愈傷組織， 得到的轉(zhuǎn)基因植株 抗蟲鑒定表明對二化螟有很高的毒性 [77]。 Xu 等通過 基因槍法將馬鈴薯蛋白酶抑制劑基因轉(zhuǎn)入水稻， 得到的轉(zhuǎn)基因水稻抗蟲性 明顯 提高 [71]。謝道昕 等 1991 年 用花粉管通道技術(shù)將 Bt 基因?qū)胨局谢?11 號(hào) 中 [38]，楊虹、謝道昕 等 轉(zhuǎn)化 所用 Bt 基因是直接從蘇云金 芽孢 桿菌中分離克隆 得到的，經(jīng)分子生物學(xué)方法 檢測證明 Bt 基因已 成功 整合到水稻基因組中。因此， 在構(gòu)建載體時(shí)要選擇合適的篩選標(biāo)記基因， 在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化后 確定相適應(yīng)的 篩選劑，篩選濃度及篩選時(shí)間。 共培養(yǎng)后農(nóng)桿菌的抑制 農(nóng)桿菌與愈傷組織共培養(yǎng)后農(nóng)桿菌的去除與抑制對轉(zhuǎn)化效率有著極大地影響。 鄭杰認(rèn)為繼代培養(yǎng) 67d 的愈傷組織用于轉(zhuǎn)化時(shí)轉(zhuǎn)化率最高 [57]。此外， 侵染過程中加入 肌醇、較高濃度的糖類、較低濃 11 度的 pH 值和較低的共培養(yǎng)溫度 等 也有利于 vir 基因的誘導(dǎo) [51]。 Ramesh 等研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用農(nóng)桿菌超雙元 Ti 質(zhì)粒載體能轉(zhuǎn)化難以轉(zhuǎn)化的秈稻品種 [47]。隨后， Hiei等 通過利用 “超雙元 ”載體 和在共培養(yǎng)基中加入乙酰丁香酮等 改良了 轉(zhuǎn)化條件 ， 從而 提高了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化頻率 [33]。 初篩之后通過分子生物學(xué)方法進(jìn)一步篩選含目的基因的轉(zhuǎn)基因 植株。這種方法 與 PEG 法一樣 也 是以原生質(zhì)體 作 為 轉(zhuǎn)化 受體 ， 因此 也具有 原生質(zhì)體的分離制備 困難 ，操作周期長， 植株再生率低 和基因型依賴性等問題 。 基因槍法轉(zhuǎn)化水稻周期短而且不受外植體限制，幼胚、成熟胚的胚性愈傷組織 ，原生質(zhì)體及根尖和芽尖的分生組織 等多種外植體 都能應(yīng)用 基因槍轉(zhuǎn)化法 進(jìn)行轉(zhuǎn)化 。 （ 3）幼嫩 的 子房、卵細(xì)胞 通過直接對 幼嫩的子房、 未成熟的卵細(xì)胞及種胚注射外源 DNA 的 方法 導(dǎo)入外源基因 [31]， 此方法 易于得到轉(zhuǎn)基因種子， 避免 了 轉(zhuǎn)化體夭亡及不育現(xiàn)象 ，避開了 繁瑣的細(xì)胞及組織培養(yǎng)過 程 ，但是 轉(zhuǎn)化后代群體較大，轉(zhuǎn)基因植株的篩選與檢測工作量較大。 而根癌 農(nóng)桿菌介導(dǎo) 的 遺傳轉(zhuǎn)化 ，則需 構(gòu)建含 TDNA 的載體， 將目的基因插入 TDNA，以適應(yīng) 農(nóng)桿菌 通過 TDNA 將目的基因?qū)?并整合到 受體基因組 中 ， 現(xiàn)在研究 最常用的是 Ti 質(zhì)粒 [29]。 構(gòu)建嵌合基因 基因的表達(dá)調(diào)控主要是 依靠其本身的調(diào)控序列 ，如啟動(dòng)子和 終止子 ， 而不是其編碼序列。來自煙草天蛾的蛋白酶抑制劑基因轉(zhuǎn)入棉花和煙草表現(xiàn)較弱 的抗性 [24]。 同時(shí) 還發(fā)現(xiàn) ，外源凝集素還可 通過 促進(jìn)消化道內(nèi)細(xì)菌的繁殖并 誘發(fā)病灶，對害蟲的消化道造成損傷。其抗蟲機(jī)理 是 在昆蟲的消化道內(nèi) PI 能與蛋白消化酶作 用，形成酶抑制劑復(fù)合物 (EI)，消化酶的蛋白水解作用 被阻斷或減弱 ；同時(shí)， 消化酶在 EI 的刺激下會(huì) 過量分泌，通過神經(jīng)系統(tǒng) 的反饋?zhàn)饔?，使昆蟲 產(chǎn)生厭 食 反應(yīng) 或消化不良，從而 殺死昆蟲 達(dá)到抗蟲目的 [10]。據(jù)粗略統(tǒng)計(jì)，已經(jīng)有60 余種 Bt 基因被報(bào)道。 隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，植物抗蟲基因工程 研究不斷深入，人們對農(nóng)作 物 蟲害的防治逐漸形成了新的思路與途徑。 Agrobacterium tumefaciensmediated VI 縮寫詞 (Abbreviation) 縮寫名 英文名 中文名 6BA 6Benzylaminopurine 6芐基氨基嘌呤 AS Acetosyringone 乙酰丁香酮 2, 4 D 2,4Dichlorophenoxy acetic acid 2, 4二氯苯氧乙酸 bp Base pair 堿基對 Ti Timentin 替曼汀 Hyg Hygromycin B 潮霉素 B t Bacillus thuringiensis 蘇云金芽孢桿菌 NAA Naphthalene acetic acid 萘乙酸 OD Optical density 光密度 PCR Polymerase chain reaction 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) Rif Rifampicin 利福平 SDS sodium doaecyl sulfate 十二烷基硫酸鈉 EB Ethidium bromide 溴化乙錠 Kan Kanamycin 卡那霉素 KT Kiin 激動(dòng)素 EDTA Ethylenediamietraacetic acid 乙二胺四乙酸 VII 目錄 摘要 .................................................................................................................................I Abstract ............................................................................................................................. IV 縮寫詞 (Abbreviation).......................................................................................................... VI .......................................................................................................................... 1 抗蟲基因的種類及特點(diǎn) ............................................................................................... 1 Bt 毒蛋白基因 .................................................................................................... 2 蛋白酶抑制劑基因 ............................................................................................. 3 植物外源凝集素基因 ......................................................................................... 4 淀粉酶抑制劑基因 ............................................................................................. 4 動(dòng)物來源的抗蟲基因 ......................................................................................... 4 其它抗蟲基因 .................................................................................................... 5 抗蟲基因存在的主要問題及解決策略 ................................................................. 5 水 稻基因工程育種的技術(shù)體系 ..................................................................................... 6 構(gòu)建嵌合基因 .................................................................................................... 6 選擇轉(zhuǎn)化載體 .................................................................................................... 7 選擇轉(zhuǎn)化受體 .................................................................................................... 7 轉(zhuǎn)化方法 ........................................................................................................... 8 轉(zhuǎn)化體的篩選和轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定 ............................................................. 9 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化的研究 .............................................................................. 9 農(nóng)桿菌菌株與質(zhì)粒載體 .....................................................................................10 農(nóng)桿菌 Vir 區(qū)基因活性的誘導(dǎo) ...........................................................................10 培養(yǎng)基成分 ...................................................................................................... 11 愈傷組織的預(yù)處理 ............................................................................................ 11 農(nóng)桿菌懸浮侵染環(huán)境 ........................................................................................ 11 共培養(yǎng)環(huán)境和時(shí)間 ............................................................................................ 11 共培養(yǎng)后農(nóng)桿菌的抑制 .....................................................................................12 篩選標(biāo)記基因以及篩選劑的選擇 .......................................................................12 轉(zhuǎn)抗蟲基因水稻 .........................................................................................................13 轉(zhuǎn) Bt 基因水稻 .................................................................................................13 其它抗蟲基因水稻 ............................................................................................13 轉(zhuǎn)抗蟲基因水稻安全性研究 .......................................................................................14 轉(zhuǎn)抗蟲基因水稻的食品安全性問題 ...................................................................14 轉(zhuǎn)抗蟲基因水稻的生態(tài)安全性問題 ...................................................................15 本研究的立題依據(jù)與目的意義 ....................................................................................15 ..........................