【正文】 。 轉(zhuǎn)化體的篩選和轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定 在 轉(zhuǎn)化過(guò)程 中， 通常將 外源基因與篩選標(biāo)記基因共同轉(zhuǎn)化受體，為鑒定 轉(zhuǎn)化受體是否轉(zhuǎn)進(jìn) 了外源基因， 一般 通過(guò) 對(duì) 標(biāo)記基因 的檢測(cè) 進(jìn)行 初步 篩選 。整個(gè)操作過(guò)程 需要的設(shè)備簡(jiǎn)單， 成本低，但原生質(zhì)體 分離 制備 困難， 培養(yǎng)周期長(zhǎng)， 培養(yǎng)條件高，且 再生頻率低， 依賴 于 基因型 等，從 而 使 這一方法的 應(yīng)用 受到限制。 然而由于水稻品種間的遺 傳差異比較大，且 此方法對(duì)轉(zhuǎn)化受體的基因型依賴性強(qiáng)，從而增大了轉(zhuǎn)化過(guò)程的復(fù)雜性和隨機(jī)性。 （ 2）原生質(zhì)體 20 世紀(jì) 80 年代末至 90 年代初， Toriyama 等用 PEG 法 成功 轉(zhuǎn) 化了 水稻 的 原生質(zhì)體 ， 得到的 水稻轉(zhuǎn)基因植株 可育 [30]后， 人們開(kāi)始 將水稻 原生質(zhì)體作為 PEG 法轉(zhuǎn)化水稻的 受體 。常用的報(bào)告基因有 綠色熒光蛋白基因 (gfp)和 α葡糖苷酸酶基因(gus)等 [28]。 6 針對(duì)目前 植物 轉(zhuǎn) 抗蟲(chóng)基因 后 存在的 主要 問(wèn)題， 我們可以采取 下 列措施 來(lái) 解決 :（ 1） 對(duì)已有的基因進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆肿有揎?或 改造，也可以 人工合成 新的抗蟲(chóng)基因 以提高其抗蟲(chóng)性； （ 2） 從自然界中分離更多 、 更有效的抗蟲(chóng)基因； （ 3） 同時(shí)使用兩個(gè)或兩個(gè)以上的抗蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)化 同一種 植物 ，或多次轉(zhuǎn)化，獲得抗蟲(chóng)基因 集中的植物 ； （ 4）應(yīng)用 更新 、更專一地 能 高效 調(diào)控基因表達(dá)的 啟動(dòng)子以調(diào)節(jié)基因的表達(dá)；（ 5） 在作物栽培上采取 “高劑量 /避難所 ”策略，即 轉(zhuǎn)基因植物與非轉(zhuǎn)基因植物間隔種 植， 與生態(tài)防治相結(jié)合 。但這些抑制劑基因轉(zhuǎn)入植物后并未產(chǎn)生抗性或產(chǎn)生較弱的抗性。 植物外源凝集素基因 外源凝集素 (Lectin)存 在 于自然界 許多植物中 ， 是分布 較為廣泛 的一類非免疫球蛋白，其中豆科植物 的種子 中 含量最 為 豐富。其分類如表 [8]。當(dāng)被昆蟲(chóng)攝食之后在昆蟲(chóng) 的腸道內(nèi)經(jīng)蛋白酶水解轉(zhuǎn)變?yōu)閹в心┒饲?具 有殺蟲(chóng)活性的毒性多肽分子，它可與敏感昆蟲(chóng)中腸上皮細(xì)胞表面的特異受體相互作用誘導(dǎo)細(xì)胞膜產(chǎn)生一些特異性小 孔擾亂細(xì)胞內(nèi)外的 滲透 壓，引起細(xì)胞膨脹甚至裂解 ， 從而導(dǎo)致昆蟲(chóng)停止進(jìn)食， 最終死亡 [5]。 長(zhǎng)期以來(lái)，害蟲(chóng)防治過(guò)多的依賴于化 學(xué)農(nóng)藥。 Cry30Fa1and Cry54Aa1。 3. 通過(guò)對(duì)洗菌后及分化前愈傷組織的干燥處理，改良農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系。而秈稻的組培特性普遍較差，再生率很低，導(dǎo)致一些生產(chǎn)上應(yīng)用價(jià)值較大的優(yōu)良品種轉(zhuǎn)化仍然 難以成功或轉(zhuǎn)化頻率低，因而研究?jī)?yōu)質(zhì)秈稻的愈傷組織形成和植株再生能力對(duì)于遺傳轉(zhuǎn)化率提高十分必要。蟲(chóng)害是造成水稻減產(chǎn)減收的主要原因之一。 近年來(lái)轉(zhuǎn) Bt 基因抗蟲(chóng)水稻已經(jīng)在生產(chǎn)上得到了廣泛的應(yīng)用，隨著抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因水稻的大規(guī)模種植， Bt 基因抗蟲(chóng)譜相對(duì)狹窄及害蟲(chóng)易產(chǎn)生耐受性等問(wèn)題相繼引起了人們的關(guān)注。測(cè)序鑒定得到序列正確的陽(yáng)性載體，用內(nèi)切酶切下目的基因片段并插 pCDMARHyg 載體，最終獲得高效表達(dá)雙元載體pCDMARCry30Fa1Hyg 與 pCDMARCry54Aa1Hyg， 并通過(guò)酶切和測(cè)序的方法鑒定出 上述載體的正確性。s population taking it as their staple food. However， insect damage is one of the main reasons to decrease the rice yield. There are a large variety of rice pests in China. The rice production loss is more than 5% of total yield because of insect damage. At present, the main method to control rice pest is to utilize chemical pesticides. However, it caused a lot of problems, such as environmental pollution, higher production cost, food safety, etc. Breeding new rice varieties that produce insecticidal proteins by themselves is undoubtedly the most economical and security strategy. On the basis of previous reports, it is difficult to solve the problem by traditional breeding because of rice germplasm resources are scarce. Given this, it is more important to use geic engineering to breed resistant rice. In recent years, pest resistant rice with Bt genes in production have already been on a wide range of applications. With largescale cultivation of insectresistant transgenic rice, Bt gene zoophobous spectrum is relatively narrow and tolerance to pests and other problems have been attracted the attention of people. Therefore, separating and cloning new pest resistant genes from the natural world became more and more effective methods to solve these problems. Indica rice is a major subspecie of Asian cultivated rice, and more than 80% of the rice cultivars in the world belongs to indica rice, so it is important significance to study tissue culture. Tissue culture of indica rice is generally poor and regeneration rate is very low, causing some production value on a large varieties of transformation are still difficult to successfully transform or frequency low. Therefore, the study of high quality indica rice callus formation and plant regeneration ability of geic transformation rate is necessary. Agrobacterium tumefaciensmediated transformation has technique advantages including low copies, and is widely used in the study of insectresistant transgenic rice. However, the relatively large geic differences between different varieties of rice, and the transformation strong dependence on rice genotypes, increase plexity and randomness of the Agrobacterium tumefaciensmediated transformation in rice. Therefore, the optimization of Agrobacterium tumefaciensmediated rice transformation system to V improve transformation rates is necessary. This research has the following main areas of work: 1. Seqences of new Bt genes Cry30Fa1 and Cry54Aa1 that had been added cleavage site sequences at both ends, were sent to gene pany to synthesis. Then all of target gene fragments and middle cloning vector pUPROK were cut separately by two enzymes and connected to form middle carriers of the target gene fragments. Positive vectors were got by sequences identification, and were digested by endonuclease to separate target gene fragments. Then target gene fragments were inserted into pCDMARHyg vector to form eventual expression binary vectors pCDMARCry30Fa1Hyg and pCDMARCry54Aa1Hyg. All of positive plasmids were identified by digestion and sequencing. 2. By optimizing callus subculture time and different concentration of Ascorbic acid (Vc) in subculture media, callus growth state was adjusted and embryo callus were increased. Results showed that when R125 and R818 callus were subcultured 2 to 3 times, the differentiation rate was the highest。 同時(shí)， 水稻也是蟲(chóng)害最多的糧食作物之一，田間害蟲(chóng)種類達(dá) 624 種以上，每年 僅由于螟蟲(chóng)危害所造成的直接經(jīng)濟(jì)損失就達(dá) 億元，使用化學(xué)殺蟲(chóng)劑防治螟蟲(chóng)的費(fèi)用每年達(dá) 億元，所以每年由稻螟 蟲(chóng) 危害引起的總經(jīng)濟(jì)損失就能達(dá)到 億元 [3]。 抗蟲(chóng)基因的種類及特點(diǎn) 目前 我們 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并獲得了很多種抗蟲(chóng)基因， 這些抗蟲(chóng)基因 根據(jù) 來(lái)源進(jìn)行分類， 大體可以分為 以下 三類 ：第一類是從細(xì)菌如蘇云金芽孢桿菌中 分離得到的抗蟲(chóng)基因，主要是 Bt 毒蛋白基因；第二類是從植物中分離出來(lái)的基因，包括 2 蛋白酶抑制劑基因，外源凝集素基因，淀粉酶抑制劑基因等；第三類是從動(dòng)物體內(nèi)分離出來(lái) 的 毒素基因，如 蜘蛛毒素基因和蝎毒素基因 等 [4]。根據(jù)它們殺蟲(chóng)譜的范圍，可將 Bt 殺蟲(chóng)基因分成六大類，即 CryⅠ 、 CryⅡ 、 CryⅢ 、CryⅣ 、 CryⅤ 和 Cyt。目前已經(jīng)有 多種植物導(dǎo)入 了 絲氨酸 蛋白酶抑制劑基因 ， 其中豇豆胰蛋白酶抑 制劑（ CpTI）是 抗蟲(chóng)效果 最為有效的 絲氨酸 蛋白酶抑制劑，現(xiàn)已 有多種植物如 棉花 [13]、煙草 [14]、水稻 [15]等 導(dǎo)入了 CpTI 基因 ，獲得的轉(zhuǎn)基因植株 對(duì)鱗翅目和鞘翅目害蟲(chóng) 均具 有較好的抗蟲(chóng)效果。 其 抗蟲(chóng)機(jī)理是 аAI 能抑制昆蟲(chóng)消化道內(nèi)的 α淀粉酶 活性， 致使 昆蟲(chóng) 攝取食物中 的 淀粉進(jìn)入消化道后 不能 被 消化，導(dǎo)致害蟲(chóng) 不能正常的攝取能量， 從而 引起 非正常發(fā)育或死亡 [22]。 其它抗蟲(chóng)基因 膽固醇氧化酶 (Cholesterol Oxidase,cho)基因和營(yíng)養(yǎng)殺蟲(chóng)蛋白 (Vegetative insecticidal protein， vip)基因都是 來(lái)源于鏈 霉菌屬的第二代抗蟲(chóng)基因，它們都有較強(qiáng)的殺蟲(chóng)活性。而終止子大多采用胭脂堿合成酶基因 (nos)的終止子 (nost)[27]。目前， 用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的受體主要有下列 幾種： （ 1）愈傷組織 愈傷組織 是 目前 水稻遺傳轉(zhuǎn)化 應(yīng)用最為廣泛的轉(zhuǎn)化受體 ，用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的愈傷組織大多是由水稻成熟胚、幼胚、幼穗誘導(dǎo)得到的胚性愈 傷組織。 20 世紀(jì) 90 年代以后 ，人們對(duì)農(nóng)桿菌 的 侵 染機(jī)理做 了深入的研究， 對(duì)整個(gè) 轉(zhuǎn)化過(guò)程了解 清楚后 ，針對(duì)單子葉植物對(duì)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化 過(guò)程進(jìn)行了 適當(dāng)?shù)馗牧?， 使應(yīng)用此法對(duì) 水稻，玉米等 單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化 取得了成功。 基