第10章基因分析的基本策略(編輯修改稿)
2025-03-26 01:08 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 術(shù)來鑒定。 近年來，隨著 PCR技術(shù)的不斷改進(jìn)，如差異顯示PCR和實(shí)時(shí) PCR的發(fā)明，可以用于基因拷貝數(shù)的分析。 ? 根據(jù) Poly A序列起點(diǎn)前 2個(gè)堿基除 AA外只有 12種可能性的特征，設(shè)計(jì)合成了 12種下游引物，稱 3′錨定引物 ； ? 同時(shí)為擴(kuò)增出 polyA上游 500bp以內(nèi)所有可能性的 mRNA序列，在 5′端又設(shè)計(jì)了 20種 10bp長(zhǎng)的隨機(jī)引物 。 ? 這樣構(gòu)成的引物對(duì)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增能產(chǎn)生出 20230條左右的 DNA條帶，其中每一條都代表一種特定 mRNA種，這一數(shù)字大體涵蓋了在一定發(fā)育階段某種細(xì)胞類型中所表達(dá)的全部 mRNA。 （ 1）差異顯示 PCR用于基因拷貝數(shù)分析 ? 將差別表達(dá)條帶中的 DNA回收，擴(kuò)增至所需含量，進(jìn)行 Southern blot或 Northern blot或直接測(cè)序，從而對(duì)差異條帶鑒定分析，以便最終獲得差異表達(dá)的目的基因。 ? 差異顯示 PCR方法仍然存在幾個(gè)難以解決的問題： (1)重復(fù)率低，至少有 20%的差異條帶不能被準(zhǔn)確重復(fù)； (2)假陽性率可以高達(dá) 90%； (3)獲得的差異表達(dá)序列極少包含編碼信息。 （ 2）代表性差異分析技術(shù) 該技術(shù)是將差減雜交與 PCR有機(jī)結(jié)合形成的一種方法 .主要步驟 : 將對(duì)照組 (driver)和待測(cè)組 (tester)mRNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA片段群 ,接上接頭進(jìn)行第一次 PCR擴(kuò)增 。 將兩組 PCR產(chǎn)物片段群用 限制性內(nèi)切酶酶切 ,形成平均長(zhǎng)度 256bp的長(zhǎng)度； 將接頭消化 , 在 tester組末端接上新的接頭 ,tester組和driver組按 1:100比例混合，過量的 driver可與 tester中互補(bǔ)的部分形成雙鏈； 復(fù)性 , 按新接頭序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行第 2輪 PCR，只有tester和 tester雜合體才能和引物配對(duì) , 大量擴(kuò)增； ? 實(shí)時(shí) PCR根據(jù) PCR反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)設(shè)計(jì)的分析方法。在 PCR反應(yīng)的初始階段，反應(yīng)體系中的模板的產(chǎn)物濃度較低，而引物是過量的，產(chǎn)物和模板復(fù)性不會(huì)形成與引物競(jìng)爭(zhēng)，此時(shí)產(chǎn)物含量呈指數(shù)增加。 ? 當(dāng) PCR產(chǎn)物積累后，產(chǎn)物的復(fù)性可以競(jìng)爭(zhēng)引物與模板的結(jié)合，產(chǎn)物增加減慢，最后進(jìn)入平臺(tái)期。所以對(duì)樣品中的 cDNA進(jìn)行定量分析的最佳時(shí)期是反應(yīng)早期。 （ 3）實(shí)時(shí) PCR用于基因拷貝數(shù)分析 ? 實(shí)時(shí) PCR原理是：在 PCR反應(yīng)體系中加入一種雙色熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針，并根據(jù)探針上熒光信號(hào)的變化計(jì)算模板 DNA含量。如： TaqMan系統(tǒng)。 ? 在寡核苷酸探針的 5`端標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光染料 ， 3`端標(biāo)記一個(gè)猝滅染料 。當(dāng)光源照射到探針時(shí)，被激活的報(bào)告熒光染料將能量轉(zhuǎn)移給附近的猝滅染料而不發(fā)光。 ? 當(dāng) PCR產(chǎn)物擴(kuò)增時(shí)，聚合酶遇到結(jié)合在模板上的熒光探針時(shí)，利用聚合酶所具有的 5`3`外切酶作用，將兩種染料分離，因此根據(jù)報(bào)告熒光所發(fā)射的熒光強(qiáng)度與被切探針成正比，由此可以計(jì)算出 PCR產(chǎn)物的含量。 ?實(shí)時(shí) PCR技術(shù)特別適合于低拷貝基因的定量。 ?實(shí)時(shí) PCR需要包括熱循環(huán)儀、計(jì)算機(jī)、光學(xué)儀器用于熒光激發(fā)和收集器、數(shù)據(jù)處理和分析軟件。 ROMA分析基因拷貝數(shù) ? ROMA（代表性寡核苷酸陣列分析）：是將 RDA與芯片微距陣分析技術(shù)相結(jié)合。 ? 利用人類基因組序列預(yù)測(cè)并設(shè)計(jì)了能與代表性片段雜交的寡核苷酸探針，制成芯片，然后與 RDA篩選出來的代表性差異 PCR產(chǎn)物在芯片上進(jìn)行雜交，用計(jì)算機(jī)分析雜交結(jié)果。 ? 核酸保持在細(xì)胞或組織切片中，經(jīng)適當(dāng)方法處理細(xì)胞或組織后，將標(biāo)記的 核酸探針 與 細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱為 原位雜交 。 ? 原位雜交不需要從組織提取核酸，對(duì)組織中含量極低的靶序列有 很高的靈敏度 ，并可 完整保持組織與細(xì)胞形態(tài) ，更能準(zhǔn)確反映出組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)。 三、原位雜交技術(shù)可以分析基因在染色體上位置 ? 根據(jù)檢測(cè)對(duì)象不同可將原位雜交分為 細(xì)胞內(nèi)原位雜交和 組織切片原位雜交 。同時(shí)原位雜交既可檢測(cè) DNA，也可檢測(cè) RNA，所用探針不同而已。 ? 核酸探針根據(jù)標(biāo)記方法的不同可粗略分為 放射性探針和 非放射性探針 兩類。放射性同位素標(biāo)記探針具有放射性既污染環(huán)境，又對(duì)人體有害，且受半衰期限制等缺點(diǎn)，非放射性探針可以用生物素、地高辛 、熒光素標(biāo)記探針。 （一） 固定 ：保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最大限度地保持細(xì)胞內(nèi)DNA或 RNA的水平；使探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織。最常用的固定劑是多聚甲醛，其它的固定劑（如戊二醛）。 （二） 玻片和組織切片的處理 ：包括玻片處理、細(xì)胞組織切片的處理、降低背景、預(yù)雜交。 （三） 雜交 ：調(diào)整探針的濃度（ ～ ） 、探針長(zhǎng)度（ 50～ 100個(gè)堿基）、雜交的溫度和時(shí)間。 基
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